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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 184 (2023) Citar este artículo

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La microfluídica de gotas ofrece una plataforma a partir de la cual se han propuesto nuevas tecnologías de análisis molecular digital, detección de enfermedades, curación de heridas y síntesis de materiales. Sin embargo, las tecnologías comerciales actuales de generación de gotas, ensamblaje e imagen son demasiado costosas y rígidas para permitir un ajuste rápido y de amplio rango de las características/cargas de las gotas. Este cuello de botella de creación rápida de prototipos ha limitado una mayor expansión de su aplicación. En este documento, se presenta un kit de microfluidos de gotitas de pipeta hecho en casa de bajo costo. Este kit incluye puntas de pipeta elípticas que se pueden fabricar con una herramienta simple de bricolaje (hágalo usted mismo), un chip único de imágenes de centro poco profundo basado en cinta o impreso en 3D que permite el rápido montaje/inmovilización de gotas monocapa e imágenes con un dispositivo inteligente. cámara de teléfono o microscopio en miniatura. Las gotas se generan mediante pipeteo manual o automático sin bombas microfluídicas caras y vinculadas al laboratorio. El tamaño de las gotas y la viscosidad/tensión superficial del fluido pueden variar significativamente debido a nuestros diseños particulares de generación de gotas, montaje e imágenes. La versatilidad de este kit de creación rápida de prototipos se demuestra con tres aplicaciones representativas que pueden beneficiarse de una plataforma de microfluidos de gotas: (1) gotas como microrreactores para la reacción de PCR con transcripción inversa para detectar y cuantificar los ARN diana. (2) Las gotitas como microcompartimentos para el cultivo de espirulina y los cambios ópticos de color/turbidez en las gotitas con espirulina confirman el éxito del cultivo fotosintético. (3) Gotitas como plantillas/moldes para la síntesis controlada de microgeles Janus compuestos de poliacrilamida/oro recubiertos de oro. Por lo tanto, el kit portátil fácil de fabricar y fácil de usar es ideal para laboratorios de diseño, capacitación y educación.

La microfluídica de gotas se ha convertido en una poderosa herramienta para una variedad de aplicaciones multidisciplinarias1,2. Las emocionantes tecnologías biotecnológicas comercializadas y propuestas basadas en microfluidos de gotas incluyen el ensayo de una sola célula3,4, la PCR digital de gotas5,6, la detección rápida del cáncer7,8, la detección de fármacos o inmunoterapia9,10, la detección de susceptibilidad a los antibióticos11, los aloinjertos de islotes implantables12,13, etc. para esas y muchas otras aplicaciones, las gotas se utilizan normalmente como microrreactores, microcompartimentos o plantillas/moldes y un gran número de ellas garantiza las ventajas únicas de la microfluídica de gotas14,15,16,17. Un buen ejemplo es la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (ddPCR), que utiliza gotas como microrreactores6,18. Simplemente dividiendo la mezcla de reacción de PCR en muchas gotas uniformes, los ácidos nucleicos objetivo se distribuyen en las gotas de acuerdo con la distribución de Poisson y se pueden cuantificar posteriormente a una resolución de copia única después de la amplificación por PCR19. El rendimiento mejorado se ve reforzado por una gran cantidad de gotas (104–106) que mitiga las influencias de los inhibidores o no objetivos y permite la cuantificación absoluta sin la tediosa construcción de curvas estándar20,21. Otro ejemplo es la encapsulación de células/microorganismos en gotitas o microgeles derivados de gotitas que podrían proporcionar numerosos microcompartimentos con los microambientes biofísicos/bioquímicos adecuados para un estudio de alto rendimiento de células individuales aisladas y microorganismos para acelerar la detección y optimización a gran escala incluso con el análisis de ensayo secuencial permitido. por microgeles permeables13,22,23,24,25,26,27,28. Además de las aplicaciones de microrreactores y microcompartimentos, se han sugerido gotitas como microplantillas/moldes para la síntesis de micro/nanomateriales blandos y duros29,30,31. El tamaño en miniatura controlado, la gran área de superficie por unidad de volumen, el confinamiento y la gran cantidad de gotitas permiten una síntesis fácil de materiales con las estructuras y funcionalidades deseadas debido a los rápidos efectos de segregación y concentración introducidos por el alto gradiente de hidrofobicidad, la fuerte interacción entre el tensioactivo y la superficie y el hacinamiento. efectos32,33. La microfluídica de gotas ha inspirado claramente varias tecnologías prometedoras en numerosas disciplinas.

Sin embargo, los sistemas actuales de generación de gotas1,14,34, que a menudo requieren chips/dispositivos sofisticados y/o fuentes de presión de precisión (que cuestan más de cinco mil dólares para los kits comerciales de generación de gotas de PreciGenome, Elveflow, Fluigent, etc.), no son lo suficientemente simples. , barato y accesible para permitir una fácil creación de prototipos y capacitación, lo que limita la amplia implementación de tecnologías de microfluidos de gotas en campos interdisciplinarios y un mayor desarrollo de nuevas tecnologías en productos comercializables. Por ejemplo, la tecnología de generación de gotas centrada en el flujo, ampliamente utilizada, necesita un ajuste fino con un control preciso de los flujos de dos fases en chips de microfluidos35 y la generación de gotas de emulsión escalonada, relativamente insensible a la velocidad de flujo, generalmente necesita chips/dispositivos cuidadosamente diseñados con terrazas36. Además de la generación uniforme de gotas, los métodos existentes de ensamblaje de gotas basados ​​en confinamiento y de obtención de imágenes basados ​​en microscopio también deben simplificarse para que sean más accesibles y personalizables6,37,38. Por lo tanto, un kit de herramientas de creación de prototipos simple y rápido que incluya una tecnología de generación de gotas de microfluidos sintonizable, además de módulos robustos de ensamblaje de gotas y de imágenes que sean insensibles al tamaño de las gotas y las propiedades viscoelásticas, permitiría una mayor expansión de sus aplicaciones en campos interdisciplinarios, muy similar a lo que 3D la impresión se ha hecho para biochips y otras ramas de la microfluídica39. Con este fin, basado en nuestra tecnología de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos de microfluidos gotitas de diferente tamaño y con diferentes propiedades reológicas y superficiales. (Figura 1).

Kit de microfluidos de gotitas de pipeta: (1) La ilustración esquemática de la modificación controlable de la punta de la pipeta mediante una herramienta de destornillador dinamométrico da como resultado puntas de pipeta comerciales deformadas con partes de la cabeza aplanadas. La modificación cambiará el orificio circular original de la punta de la pipeta a uno elíptico y la relación de aspecto del orificio elíptico está determinada por la fuerza de torsión del destornillador. (2) Generación de gotas con las puntas modificadas a través de una micropipeta universal. Las gotas uniformes se desprenderán automáticamente al dispensar la solución acuosa manualmente a través de un orificio de punta de pipeta debidamente deformado en aceite fluorado. (i, ii, iii) Ejemplos de aplicaciones típicas de microfluidos de gotitas sobre (i) PCR digital de gotitas con gotitas como microrreactores, (ii) cultivo de espirulina con gotitas como microcompartimentos, y (iii) síntesis controlada de microgeles con gotitas como plantillas/ moldes

La versatilidad del robusto kit se debe a tres tecnologías clave que se pueden fabricar fácil y rápidamente para permitir la máxima capacidad de ajuste. Las microgotas uniformes se generan convenientemente pipeteando líquidos desde las puntas de las pipetas con orificios elípticos para mejorar el pellizco de las gotas. Las puntas de pipeta elípticas se preparan deformando puntas de pipeta comerciales de orificio redondo con un destornillador dinamométrico de bricolaje y el tamaño de las gotas se puede ajustar simplemente cambiando la relación de aspecto del orificio de la punta de pipeta deformada. Las gotas se empaquetan e inmovilizan contra el centro poco profundo de un chip de cinta de doble cara de fácil fabricación mediante un sólido mecanismo de ensamblaje de gotas basado en el flujo de humectación impulsado por la presión capilar. La suspensión de gotitas se acerca a una geometría asimétrica estable con un menisco circular y confina las gotitas a una monocapa circular concéntrica en el centro. Las imágenes de gotas se simplifican debido a las microgotas grandes e inmovilizadas (de 300 a 500 micrones de diámetro) generadas por este kit, de modo que las cámaras de los teléfonos inteligentes pueden obtener imágenes de las gotas u observarlas visualmente. En términos de costo, la herramienta de modificación de punta basada en un destornillador de bricolaje cuesta menos de cien dólares, la punta de carga de gel cuesta menos de un centavo por punta, una micropipeta cuesta doscientos o trescientos dólares, el chip de imagen hecho de un vidrio diapositiva y varias piezas de cinta de doble cara es menos de una cuarta parte, y la imagen se puede hacer con un teléfono inteligente normal de cien dólares (se necesita un transiluminador de mil dólares o un microscopio fluorescente de mano para la imagen de fluorescencia). El kit completo para la generación, manejo e imagen de gotas (incluidas las imágenes de fluorescencia) se puede realizar con dos mil dólares, lo que es muy rentable en comparación con los kits comerciales que cuestan más de cinco mil dólares solo para la parte de generación de gotas. Además, la micropipeta, las puntas de pipeta, los portaobjetos de vidrio, las cintas de poliimida Kapton de doble cara son consumibles de laboratorio comunes y los destornilladores dinamométricos, las cámaras de los teléfonos inteligentes son herramientas comunes, lo que significa que el kit de microfluidos de gotas de pipeta propuesto aquí es extremadamente accesible. La versatilidad del kit se demuestra con tres aplicaciones de creación de prototipos de microfluidos de gotitas: (i) gotitas como microrreactores para PCR digital de gotitas para detectar y cuantificar ARN diana; (ii) gotitas como microcompartimentos para el cultivo fotosintético de espirulina; (iii) gotitas como plantillas/moldes para la síntesis controlada de microgeles compuestos de poliacrilamida/oro recubiertos de oro. Estos ejemplos típicos demuestran la versatilidad y la facilidad de uso del kit de microfluidos de gotas de pipeta para la creación rápida de prototipos y la validación de aplicaciones de microfluidos de gotas.

Para estandarizar la modificación de las puntas, se han utilizado una serie de fuerzas de torsión (directamente ajustadas y ajustadas en un destornillador dinamométrico) para producir ciertas presiones para deformar puntas de pipeta con diferentes orificios elípticos (Fig. 2, "Métodos": "Punta de pipeta elíptica preparación" para obtener más detalles sobre cómo construir y utilizar la herramienta personalizada para la fabricación de puntas). La relación entre las relaciones de aspecto de los orificios de la punta y las fuerzas de torsión aplicadas se muestran en la Fig. 3a. Una curva de calibración como esta podría brindar orientación para fabricar puntas de pipeta elípticas con las relaciones de aspecto de orificio deseadas para un tipo específico de puntas preparadas en las mismas condiciones. La herramienta casera proporciona un canal para ubicar las puntas y las barreras de intervalo en la pared del canal ayudan a determinar la longitud de la cabeza de la punta que se deforma para que las condiciones de fabricación de la punta elíptica sean más reproducibles. (Fig. 2a) Además, el ajuste de la longitud deformada (la longitud de la cabeza de la punta se deforma como se indica en la Fig. 2b a la derecha) también permite otra forma de ajustar el grado de deformación de la punta (Fig. S1).

Modificación estandarizada de puntas de pipeta para preparar puntas de cabeza aplanada. (a) La herramienta de deformación de punta simple se ensambla fácilmente con una caja impresa en 3D, dos portaobjetos de vidrio/metal, una abrazadera de acero y un destornillador dinamométrico. Cuando se usa, se inserta una punta de pipeta entre o debajo de los dos portaobjetos de vidrio/metal. Los portaobjetos de vidrio/metal no pueden girar libremente una vez ensamblados con la caja impresa en 3D y transferirán la fuerza de torsión a la presión para deformar la parte de la cabeza de la punta de pipeta comercial. (b) Ajustando el par del destornillador dinamométrico de cero a veinte, se preparan puntas de pipeta modificadas (longitud deformada: ~ 3,5 mm) con varios grados de deformación de las partes de la cabeza.

Modificación controlada de la punta de la pipeta mediante el cambio de las fuerzas de par con una longitud deformada constante (~ 3,5 mm) y la correspondiente generación de gotas de pipeta: (a) relaciones de aspecto de la sección transversal de las puntas de pipeta frente al par aplicado para la deformación de la punta, las longitudes deformadas de la punta son de ~ 3,5 mm, insertadas las imágenes son secciones transversales típicas del orificio de la punta deformada; (b) radios promedio de las gotas de agua generadas con puntas de pipeta deformadas por torsión, cada punto representa el radio promedio y la desviación estándar (barra de error) de las gotas generadas por la punta deformada correspondiente y las imágenes insertadas son gotas generadas por las puntas con sección transversal del orificio imágenes insertadas en (a). Según las curvas, se pueden preparar puntas y gotas específicas aplicando las fuerzas de torsión correspondientes.

Las puntas deformadas con diferentes longitudes deformadas y/o diferentes fuerzas de torsión se caracterizan comprobando los orificios de la punta (Figs. 2b, 3a, S1a,b, S2a,b). Con la misma fuerza de torsión, cuanto más corta esté la cabeza de la punta para compartir la presión, más deformada estará la cabeza de la punta (Fig. S1b). Asimismo, bajo la misma longitud deformada, cuanto mayor sea la fuerza de torsión aplicada, más deformada estará la cabeza de la punta (Fig. 3a, S2b). Además, las puntas de diferentes propiedades mecánicas (debido a los diferentes materiales de la punta, las dimensiones del orificio y el grosor de la pared, etc.) se comportarán y deformarán de manera diferente bajo la presión inducida por la misma fuerza de torsión (Fig. S3a). Como resultado de esto, para un nuevo tipo de puntas, se debe obtener una nueva curva de calibración correspondiente a través de un protocolo estándar.

Las puntas de pipeta deformadas están equipadas con una pipeta normal de 20 µL para la generación de gotas. Técnicamente, se generan gotas uniformes en el modo de goteo con caudales muy bajos14. Pero con las puntas de pipeta elípticas deformadas, el pellizco automático de las gotas se produce incluso con un caudal elevado debido al drenaje de agua del cuello de pellizco debido a la presión elevada del agua en el cuello. Esta presión elevada se debe a la curvatura azimutal amplificada en el extremo estrecho de la sección transversal elíptica. La presión capilar del cuello mejorada da como resultado una generación más robusta y más rápida de gotitas uniformes más pequeñas, similar a la generación de gotitas de emulsión escalonada a partir de chips microfluídicos con canales de alta relación de aspecto41 y la generación de gotitas es insensible a los cambios moderados de velocidad de flujo, lo que facilita el pipeteo manual para generar gotas uniformes. gotas. (Video S1) Como se muestra en las figuras (Figs. 3b, 4, S1c, S2c, S3b, S4), cuanto mayor sea la relación de aspecto del orificio de la punta de la pipeta, más pequeñas y uniformes serán las gotas generadas. A partir de una relación de aspecto de ~ 3,25, el coeficiente de variación (CV) de las gotas generadas se vuelve inferior al 5 % y a partir de una relación de aspecto de ~ 4, el CV de las gotas generadas se vuelve inferior al 2 %. La uniformidad de las gotas es comparable a la de los sistemas comerciales de generación de gotas, como el paquete de generación de gotas Elveflow, que afirma tener un CV de gotas de < 3 %42. Las grandes faltas de uniformidad de las gotitas generadas con puntas de baja relación de aspecto del orificio se deben a dos razones. Primero, las gotas correspondientes generadas son más grandes y las gotas más grandes son fáciles de romper en gotas satélite más pequeñas durante la generación y el manejo de las gotas. En segundo lugar, la generación de gotas con puntas menos elípticas requiere caudales más bajos y es más sensible a las perturbaciones durante el pipeteo. El rango de gotas en la Fig. 4 se puede expandir aún más usando puntas de pipeta de diferentes tamaños de orificios (Fig. S5).

Gotas de agua generadas por una serie de puntas de pipeta deformadas (puntas predeterminadas de 200 μL utilizadas en este trabajo) con varias relaciones de aspecto de orificio de punta. Generalmente, para cierto tipo de puntas, cuanto mayor sea la relación de aspecto del orificio de la punta, más uniformes serán las gotas generadas.

Una vez que se generan las gotas uniformes, otro desafío de creación de prototipos es el ensamblaje y la creación de imágenes de las gotas. Las gotas de agua más ligeras tienden a flotar en la parte superior de la fase de aceite dispersa y no se ensamblarían espontáneamente para formar monocapas para observación. Además, el aceite humectante a menudo aleja las gotitas de la posición de formación de imágenes. Estos problemas generalmente se resuelven con un diseño de chip cerrado complicado con pilares y otras barreras para confinar y empacar gotas en monocapas6,37,38. Fijar la gota en su lugar contra tales barreras requiere una contrapresión sostenida y la carga se convierte en una importante tarea microfluídica. Además, el contacto con las barreras sólidas a menudo induce la coalescencia de las gotas y, por lo tanto, requiere un flujo de carga preciso que debe ajustarse para gotas de diferente tamaño y viscoelasticidad.

El diseño de centro poco profundo de nuestro chip de ensamblaje permite el ensamblaje espontáneo en el centro del chip y, por lo tanto, permite la carga manual con una pipeta (Fig. 5 y Video S2). El conjunto de gotas también está anclado al centro debido al efecto de la altura del canal inclinado sobre el flujo de aceite humectante, aunque son más pequeñas que la altura del centro. Por lo tanto, las gotas nunca están en contacto con la pared (Fig. 5b,c y Video S2). Para minimizar la resistencia de la línea de contacto, la línea de contacto humectante evolucionará de una forma irregular a una forma simétrica del eje alrededor del centro poco profundo después de cargar la suspensión de gotas/aceite. Esta dispersión de la línea de contacto es impulsada por la dispersión del aceite humectante sobre el sustrato. Sin embargo, la fijación de la gota de suspensión al centro se debe a la presión capilar del menisco cóncavo en la periferia de la suspensión. El aceite humectante forma películas delgadas sobre el sustrato para producir un menisco cóncavo que soporta una presión de aceite de menisco negativa en relación con la presión del aire circundante43,44. La magnitud de la presión capilar es inversamente proporcional a la altura del canal en el menisco. Una protuberancia radial hacia afuera de la suspensión dará como resultado un menisco con un radio de curvatura más grande en la punta de la protuberancia, debido a la mayor altura del canal en esa posición. Este radio de menisco más grande da como resultado una presión de aceite de menisco menos negativa y drenará el líquido lejos de la protuberancia para detener el crecimiento de la protuberancia. Por lo tanto, la suspensión de aceite se aproxima a una forma radialmente simétrica en el centro: está fijada al centro poco profundo. El flujo radial durante este ajuste hacia los paquetes de axisimetría e inmoviliza las gotas hacia el centro poco profundo para formar una monocapa circular lejos de la periferia del menisco. Las gotitas se mueven hacia el centro, alejándose del menisco en la periferia de la suspensión, debido a la migración inducida por cizallamiento por la alta velocidad de cizallamiento en la línea de contacto en movimiento y la repulsión hidrofóbica mejorada por el sustrato allí43. Por lo tanto, también se fija un círculo de monocapa de gotitas ensambladas al centro poco profundo, concéntrico a la línea de contacto circular (meniscos), aunque las gotitas son más pequeñas que la altura del espacio en el centro. La línea de contacto anclada y la monocapa de gotas permanecen estables cuando la punta se inclina repetidamente, lo que permite el transporte a la instalación de imágenes. La altura de la cámara del marco de cinta de seis capas se selecciona para ensamblar e inmovilizar una monocapa única de gotitas generadas con pipeta, lo que simplifica la obtención de imágenes y el análisis de las gotitas. Las dimensiones del chip se pueden cambiar para acomodar gotas de diferentes tamaños y cantidades. Siempre que el aceite humedezca el chip que tiene una cámara con un centro poco profundo, las gotas se fijarán en el centro poco profundo de la cámara del chip para simplificar la obtención de imágenes y el manejo de las gotas. Además, se podría cortar una muesca en una esquina del marco de la cinta para que las puntas de las pipetas se puedan insertar en el centro de la cámara del chip para cargar las gotas sin levantar la película de cobertura (Fig. S6). En términos de descarga de gotas del chip, es solo un proceso inverso de carga de gotas (Video S3).

Ensamblaje de gotas y chip de imagen hecho de cinta de doble cara en un portaobjetos de vidrio: (a) esquema del chip con una punta en la esquina que muestra cómo se cargan las gotas; (b) cargar gotitas en el chip desde una esquina levantando la película de cubierta; (c) gotas de monocapa cargadas inmovilizadas en el centro poco profundo del chip para su posterior manejo e imagen.

El chip de centro poco profundo también se puede fabricar mediante impresión 3D con una resina transparente que se humedece con aceite (Fig. 6). El chip está diseñado para tener una altura inclinada desde la pared hasta el centro, que también tiene una altura de canal de unas 600 micras como para el chip basado en cinta. Como era de esperar, las gotas ensambladas permanecen inmovilizadas en el centro durante el manejo y la toma de imágenes (Fig. 6c). Un problema con este chip impreso en 3D de resina es que el chip bloquea la fluorescencia verde, posiblemente debido a los residuos del iniciador. Este problema se puede resolver si se aplica moldeo por inyección para fabricar el chip a partir de polímeros fundidos.

Un conjunto de gotitas impresas en 3D y un chip de imágenes con un enchufe combinado: (a) el modelo 3D del chip y la sección transversal para mostrar el diseño del centro poco profundo; (b) un chip impreso; (c) gotas de monocapa inmovilizadas dentro del chip para su posterior manejo e imagen. Las gotas se mantendrán alejadas de las paredes internas del chip debido a la altura inclinada de la cámara interior hacia el centro. La dimensión exterior del chip de formación de imágenes de gotas es de 20 mm × 20 mm × 2,5 mm.

Con una cantidad suficiente de microgotas de nanolitros, es posible lograr la detección y cuantificación mediante ddPCR de ácidos nucleicos individuales. Como ejemplo general, el reactivo PCR GAPDH humano se utiliza para detectar y cuantificar el ARN humano. Aquí, el ARN en lugar del ADN se elige como objetivo para que también se lleve a cabo la transcripción inversa. El kit de reactivos de PCR GAPDH humano se aplica ampliamente en laboratorios de bioingeniería/biología como un control endógeno básico para la normalización de otros ácidos nucleicos de muestra en pruebas de reacción en cadena de polimerasa cuantitativas en tiempo real a granel45,46. El económico kit de reactivos para PCR GAPDH y los ARN de control humano son, por lo tanto, ideales para fines de formación. Las gotas con la mezcla de reacción de PCR flocularán en la parte superior del aceite fluorado más denso en los tubos de PCR regulares y tenderán a coalescer durante el ciclo térmico. El problema se puede resolver agregando ~ 1% p/v de F127 a la fase acuosa como cotensioactivo.

Para la obtención de imágenes de fluorescencia de gotitas después de ddPCR, se sugieren dos enfoques para este kit. El primero es aprovechar la cámara de un teléfono inteligente común y el transiluminador que se usa con frecuencia en los laboratorios para ver geles de electroforesis. Debido a que las gotas generadas por el pipeteo suelen tener un tamaño de varios cientos de micrones, son lo suficientemente grandes como para ser observadas visualmente y capturadas por las cámaras de los teléfonos inteligentes. Con la iluminación de luz azul y el filtrado del filtro ámbar del transiluminador, se puede registrar la fluorescencia verde (tinte FAM) de las gotas (Fig. 7b). Si la combinación de teléfono inteligente y transiluminador no es práctica, un segundo enfoque es usar un mini microscopio de fluorescencia portátil económico (Fig. 7d). Ambos métodos se probaron después de la reacción de PCR y las gotas positivas (gotas con objetivos como lo indica la fuerte fluorescencia verde amplificada) son claramente observables en ambos casos (Fig. 7). Aunque la imagen de fluorescencia de gotas tomada por el mini microscopio de mano tiene mejor contraste (Fig. 7d) que la tomada por la cámara de un teléfono inteligente (Fig. 7b), la cantidad de gotas positivas perceptibles es la misma para las imágenes de los dos enfoques. Por lo tanto, existen soluciones confiables y accesibles para obtener imágenes de fluorescencia de gotas después de la reacción de ddPCR.

Imágenes de gotas de ddPCR por teléfono inteligente junto con transiluminador sin (a) o con (b) iluminación/filtrado de fluorescencia y por mini microscopio portátil sin (c) o con (d) iluminación/filtrado de fluorescencia después de 40 ciclos térmicos. Las gotas se generan a través de una punta de pipeta deformada por una fuerza de torsión de 20 pulgadas-libra. Ambos métodos son adecuados para obtener imágenes de las gotitas correctamente.

Las imágenes de fluorescencia de gotas efectivas conducen a la cuantificación de los ácidos nucleicos diana. Para fines de capacitación y creación de prototipos, la cuantificación se realiza mejor contando las gotitas positivas, sin conocer el número total de gotitas ni invocar las estadísticas de Poisson. Con un número de copias bajo, cuando las gotitas superan significativamente a los objetivos, el número total de gotitas positivas es aproximadamente igual al número total de objetivos. La cuantificación positiva de gotas requiere una pérdida de muestra insignificante durante la generación de gotas y la obtención de imágenes. Las gotas de nanolitros pipeteadas cumplen todos los requisitos para la cuantificación basada en el recuento de muestras de baja concentración objetivo. Se realizan experimentos repetidos para varias muestras de concentración objetivo baja (0–1 picogramo en 20 µL de mezcla de reacción) y los resultados de cuantificación basados ​​en el recuento de gotas positivas se muestran en la Tabla 1 y la Fig. 8. La relación lineal indica que el método es suficiente para la cuantificación aproximada y la detección precisa de muestras de baja concentración objetivo (Fig. 8). Aunque las desviaciones estándar aumentan a medida que aumentan las concentraciones objetivo, el coeficiente de variación pronto se estabiliza en el rango de 20 a 30 % (Tabla 1) y las variaciones probablemente se deban a la fluctuación de la concentración objetivo en la solución de muestra de baja concentración, la variación del volumen de la micropipeta y afinidad de la molécula diana con el tubo de PCR y las superficies de la punta de la pipeta. Además, el límite de detección calculado47 basado en el promedio de falsos positivos, la desviación estándar de las muestras en blanco y la desviación estándar de las muestras con la concentración no negativa más baja de la Tabla 1 (LoD = 0,2 + 1,645*0,45 + 1,645*1,82 = 3,92) es 3,92 copia por 20 µL de mezcla de reacción que es comparable a los productos comerciales de ddPCR e indica que la pipeta ddPCR es buena para una detección precisa a pesar de que la cuantificación basada en el conteo es más una estimación aproximada debido a las variaciones del 20 al 30 %. (Tabla 1) Aunque en esta demostración se usa ARN humano, esta técnica puede aplicarse potencialmente para cuantificar los ARN de virus y reducir la tasa de detección de falsos negativos de las pruebas de PCR para virus SARS-CoV-2 en muestras heterogéneas48,49. En consecuencia, el kit ofrece un buen entrenamiento de PCR digital de gotas para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos.

Cuantificación positiva basada en el recuento de gotas de muestras de baja concentración objetivo. Las barras de error son desviaciones estándar.

Las microgotas proporcionan microcompartimentos y microentornos aislados para que habiten las células o los microorganismos y esta característica se utiliza activamente para el análisis/detección de células individuales/microorganismos22,23,24,25 y también para fábricas emergentes de células/gotas50,51. Para muchas de estas aplicaciones, las gotas ofrecen una manipulación y un ensayo indispensables de células individuales o microorganismos. Como ejemplo, para mostrar la encapsulación de gotas con nuestro kit propuesto, la espirulina de un solo microorganismo se cultiva en microgotas pequeñas y grandes dentro de chips de imágenes basados ​​en cinta (Fig. 9) o tubos PCR (Fig. S7). La espirulina es un tipo de cianobacteria comestible con una excelente eficiencia fotosintética que produce una variedad de nutrientes e ingredientes para animales y humanos. El crecimiento fotosintético de la espirulina es vigoroso porque la alta solubilidad de O2/CO2 (10–20 veces mayor que el agua) en el aceite fluorado sustenta la proliferación de microorganismos52,53. Con el tiempo, la espirulina crece en número y eventualmente ocupa toda la gota (Fig. 9, S7). Después de 10 días de cultivo, la tasa de proliferación calculada (número de gotitas con al menos cuatro copias de espirulina/número total de gotitas con espirulina) es 96,9 ± 1,8 % a partir de seis veces de experimentos. El crecimiento de la espirulina en microgotas más pequeñas es relativamente más lento, probablemente debido al espacio más limitado y al suministro de nutrientes. (Fig. 9a–d, i, j) El confinamiento de las gotas es eficaz y no se observa que la espirulina se difunda o se transfiera a otras gotas (Fig. 9c,g,j,l). Además, el confinamiento de las gotitas aísla y protege a la espirulina por las virtudes/paredes blandas (interfases gotita/aceite) formadas con tensioactivos biocompatibles54. Aunque las gotas pueden encogerse después de días de crecimiento fotosintético debido a la evaporación del agua, las microgotas grandes generadas por la pipeta siguen siendo lo suficientemente grandes para obtener imágenes de teléfonos inteligentes y el crecimiento continuo significa que los microorganismos de la espirulina están vivos durante más de 10 días (Fig. 9e-h, S7). Las diferencias de color o turbidez provocadas por la espirulina proliferada en gotitas positivas confirman un cultivo exitoso e implican la cuantificación digital de muestras de microorganismos de baja concentración después de un cultivo adecuado, como las reportadas para la cuantificación digital de gotitas de bacterias55.

Cultivo fotosintético de espirulina en microgotas pequeñas (a–d) y grandes (e–h) dentro de chips de imágenes basados ​​en cinta: (a,e) espirulina en gotas generadas; ( b, f ) espirulina proliferada en gotitas positivas después de 5 días de cultivo; (c, g) espirulina proliferada en gotitas positivas después de 10 días de cultivo; ( d, h ) imágenes de teléfonos inteligentes de las gotas de cultivo de 10 días que muestran diferencias reconocibles de color / turbidez de gotas positivas con espirulina, especialmente en microgotas grandes; (i – l) imágenes de bajo aumento correspondientes a (a, c, e, g) respectivamente.

Intuitivamente, las gotitas son excelentes plantillas/moldes para la síntesis de microgeles. Con el inicio de la reticulación, las gotas de líquido con precursores de polimerización de acrilamida se convierten en microgeles uniformes (Fig. 10a-d). La transformación de líquido a gel en gotitas se utiliza además para sintetizar microgeles compuestos de poliacrilamida/oro con tapas de oro (Fig. 10e-h). La idea es explotar las diferentes escalas de tiempo cinético de las reacciones de gelificación/precipitación y las diferentes propiedades físicas de sus productos para modelar los materiales sintetizados. En general, la red de gel tiene un efecto de confinamiento en la reacción de síntesis interior que no solo evita la sedimentación de los precipitados sino que también introduce la adsorción/reacción superficial para producir materiales con estructuras/morfologías distintas. Por ejemplo, se han utilizado diferentes estructuras cristalinas en red de gel y líquido a granel para sintetizar monocristales estampados mediante la incorporación programable de materiales extraños56. Aquí, el precursor de gelificación de acrilamida se mezcla con citrato de sodio 100 mM y cloruro de oro (III) 50 mM y esta solución será estable durante aproximadamente 6 min antes de que ocurra una reducción notable de oro. El período de tiempo de 6 min es suficiente para la generación de gotitas de pipeta de la mezcla de 20 µL, que normalmente tarda unos 3 min en completarse. La reducción de oro en las gotas de fase líquida generadas es rápida y una buena cantidad de oro reducido precipita en el fondo de cada gota en aproximadamente 10 minutos después de la generación de gotas (Fig. 10e, f). Con exposición UV durante 2 min, las gotas de líquido se polimerizan y se entrecruzan en microgeles, mientras atrapan el oro precipitado anteriormente en el hemisferio inferior para formar tapas de oro en los microgeles (Fig. 10g,h). Después de las perturbaciones (rotación y movimiento) causadas por las manipulaciones posteriores para obtener imágenes, las tapas de oro se orientan aleatoriamente (Fig. 10h), lo que indica la formación de microgeles porque, de lo contrario, todos los espacios de oro se precipitarán hacia el fondo como en el líquido de reticulación previa. gotitas (Fig. 10f). Además, quizás debido al confinamiento y a los efectos reductores de oro de la formación de la red de poliacrilamida in situ57, el oro recién reducido se fusiona inmediatamente en nanopartículas de oro en los nanoporos de la red de gel del microgel tras la gelificación, como lo indica el clásico color rojo vino de los microgeles (Fig. 10g). Este ejemplo de síntesis controlada de microgeles compuestos de poliacrilamida/oro rematados indica que las gotitas son moldes y plantillas prometedores para la síntesis de microgeles o partículas con patrones funcionales con las estructuras y composiciones deseadas33,58.

Síntesis controlada de microgeles: (a–d) Imágenes de smartphone (a,c) y microscopio (b,d) de dos tamaños de microgeles de poliacrilamida preparados a partir de mezclas de 20 µL con diferentes puntas de pipeta. ( e, f ) Gotas con precursores de gelificación y fuentes de reducción de oro antes de la gelificación. En las gotitas en fase líquida, el oro reducido se precipitará en el fondo de las gotitas debido a su mayor densidad. Las gotitas se entrecruzan con UV para sintetizar los microgeles compuestos de poliacrilamida/oro rematados en (g,h). El proceso de gelificación UV también acelerará la reducción de oro y la red de poliacrilamida formada in situ limita el crecimiento de oro reducido para producir (g) microgeles de color rojo vino llenos de nanopartículas de oro. El oro previamente precipitado en el fondo de cada gota de líquido se fijará para preparar finalmente (h) microgeles con tapas de oro. Las imágenes de (a,c,e,g) se toman con un teléfono inteligente, mientras que las imágenes de (b,d,f,h) se toman con un microscopio de mesa.

En resumen, este trabajo ha proporcionado un kit de creación rápida de prototipos casero para microfluidos de gotas que pueden utilizar investigadores principiantes y no expertos de diversos orígenes. El desafiante y complicado flujo de trabajo de microfluidos de gotas de generación/ensamblaje/imagen de gotas, que a menudo requiere equipos comerciales costosos que son difíciles de ajustar, se simplifica mediante la generación de gotas de pipeta con puntas de pipeta elípticas de fácil fabricación, ensamblaje de gotas e inmovilización en el chip de centro poco profundo ( fabricados con cintas o impresión 3D), e imágenes de gotas por teléfono inteligente o mini microscopio portátil. Estos diseños permiten una fácil generación de gotas uniformes con diferentes tamaños y con un fluido disperso de viscosidad, tensión superficial y contenido celular arbitrarios. Se eligen y llevan a cabo tres ejemplos para demostrar las aplicaciones versátiles de esta plataforma microfluídica de gotas en moléculas individuales, microorganismos individuales y síntesis de materiales con gotas utilizadas como microrreactores, microcompartimentos y plantillas/moldes, respectivamente: (i) reacción de PCR digital de gotas en gotas para cuantificar ARN de bajo número de copias en el punto de necesidad sin comprar instrumentos costosos; (ii) cultivo fotosintético de espirulina en gotitas; (iii) síntesis controlada de microgeles compuestos de poliacrilamida/oro rematados. Aunque los tres ejemplos no se analizan en profundidad, hemos demostrado que el kit se puede utilizar para respaldar la creación de prototipos y pruebas rápidos y extensos. Por lo tanto, el kit de gotitas de pipeta debería facilitar el diseño, la creación de prototipos y la capacitación del personal en tecnologías microfluídicas de gotitas por parte de usuarios no expertos.

Para estandarizar el proceso de modificación de la punta, se ensambla una herramienta basada en un destornillador dinamométrico. Básicamente, la herramienta convierte las fuerzas de par en presiones para deformar las puntas de las pipetas. Una abrazadera de metal se combina con una carcasa impresa en 3D que evitará la rotación de los portaobjetos de vidrio/metal y el movimiento de las puntas de pipeta mientras se deforman. Se proporciona un archivo de modelo del caso impreso en 3D en Información de apoyo.

Para la preparación de una punta de pipeta elíptica, la parte de la cabeza de una punta de orificio redondo regular (puntas de carga de gel Fisherbrand™, 1–200 μL, puntas predeterminadas utilizadas en este trabajo si no se especifica otra) se inserta entre o debajo de los dos vidrios. /correderas de metal montadas en la herramienta de modificación de la punta. El canal en el estuche impreso en 3D ayuda a ubicar las puntas y las barreras de intervalo en las paredes del canal ayudan a determinar cuánto tiempo se inserta la punta para que se deforme, de modo que las puntas se deformen de una manera más controlable y reproducible. Una determinada fuerza de torsión se establece directamente en el destornillador dinamométrico y el destornillador se usa para atornillar el tornillo en la abrazadera de metal hasta que se alcanza la torsión deseada. Después de diez segundos, se libera el torque y se retira la punta deformada. Mientras el destornillador comprime la punta, los portaobjetos de vidrio/metal no pueden girar libremente en la caja impresa en 3D y, por lo tanto, transforman el par en presión para deformar la parte de la cabeza de la punta de la pipeta a la sección transversal elíptica deseada. Los portaobjetos de vidrio rígido se romperán cuando la fuerza de torsión supere las 20 pulgadas-libra, y se pueden usar placas/portaobjetos de metal u otro material más resistente para deformar las puntas bajo fuerzas de torsión de deformación más altas.

Para la medición de las relaciones de aspecto del orificio de la punta, se cortan piezas de ~ 2 mm de largo del orificio de las puntas deformadas o tal como se compraron con cuchillas de afeitar nuevas y las piezas cortadas se adhieren verticalmente a una cinta Kapton de poliimida de doble cara con un lado de la cinta ya unido a un portaobjetos de vidrio normal. Para facilitar la obtención de imágenes, las superficies del orificio de la punta original están en contacto con la superficie de la cinta. Luego, los orificios de la punta en el portaobjetos de vidrio se toman imágenes con un microscopio (Olympus IX71) y los dos ejes (largo y corto) de los orificios se miden mediante dos segmentos de línea de coordinación ortogonal en Adobe Illustrator (Fig. S8). Brevemente, para una imagen del orificio de la punta, se dibuja una línea para indicar el eje largo y luego la línea se copia en su lugar y se gira 90°. La línea copiada y rotada se ajusta a la longitud del eje corto del orificio (solo se cambia la longitud, no hay rotación ni desplazamiento de la línea para que las líneas del eje largo y corto sean perpendiculares entre sí y se crucen en el punto medio del eje largo). Finalmente, las longitudes de las dos líneas se registran y se utilizan para calcular la relación de aspecto, es decir, (longitud del eje largo)/(longitud del eje corto).

La punta de la pipeta con la cabeza aplanada se conecta a una micropipeta normal de 20 µL. Luego, se aspiran ~ 10 µL de aceite fluorado (HFE 7500 con 2 % en peso de tensioactivo RAN-008, RAN Biotechnologies) en la punta de la pipeta y, posteriormente, se pipetea fuera de la punta en un tubo de PCR de 200 µL (Cole-Parmer, artículo n.° EW -67103-90) precargado con 40–50 µL de aceite fluorado. La punta de la pipeta se seca al aire durante unos 50 s. A continuación, se utiliza la micropipeta con la punta deformada para aspirar el líquido de muestra. La punta de la pipeta con el líquido de muestra se inserta en los 40–50 µL de aceite fluorado precargados en el tubo de PCR de 200 µL. Después de unos segundos, el aceite humedecerá el interior y alrededor de la superficie del orificio de la punta. En algunos casos (como con líquidos de muestra viscosos, puntas muy deformadas, etc.) el aceite no humedece mucho el interior del cabezal de la punta, sería útil ajustar la micropipeta hacia atrás para aumentar el volumen entre 0,5 y 1 µL para llevar el aceite al cabezal de la punta. y humedezca las superficies internas de la punta. Después de humedecer el cabezal de la punta con aceite, el líquido de muestra dentro de la punta se pipetea lentamente en el aceite para lograr un pellizco automático en gotas uniformes. El caudal de pipeteo recomendado es inferior a 10 µL/min. Dado que la generación de gotas no es sensible a pequeños cambios en la velocidad de flujo, es posible el pipeteo manual para lograr la generación de gotas para puntas elípticas de alta relación de aspecto. Sin embargo, se recomienda una micropipeta eléctrica con un caudal controlado para la generación automática de gotas de pipeteo.

Nuestro exclusivo chip de centro poco profundo está hecho de seis capas de cinta de poliimida común de doble cara en un portaobjetos de vidrio y la parte superior está cubierta por una pieza de la película de protección de la cinta (revestimiento de la cinta) después de cortar una cámara de la cinta en capas para las gotas. cargando. Al colocar la película de protección de la cinta (el lado de la película que originalmente estaba en contacto con la cinta se mira hacia abajo y luego se fija al marco de la cinta), la película transparente en el centro del marco de la cinta se presiona sobre la superficie del portaobjetos de vidrio simplemente con el pulgar y luego la falda de la película transparente se adhiere firmemente al marco de la cinta. Debido a que la película transparente en el centro se presiona hacia abajo durante el recubrimiento, aunque la película rebota un poco después de liberar la presión, el espacio entre la película y el portaobjetos de vidrio se vuelve más estrecho en el centro del trozo de cinta (Fig. S9). Se recomienda presionar la película con fuerza tanto en el centro de la superficie del portaobjetos de vidrio como en el faldón del marco de la cinta para que el espacio central sea lo más estrecho posible, especialmente para los marcos de cinta adhesiva, de modo que quede un centro poco profundo incluso después de levantar el conner. durante la carga de la muestra. Una vez que hay un centro poco profundo, no es necesario un control muy preciso de la altura del espacio angosto. Antes de cargar las muestras, la fase de aceite puro podría usarse para probar el chip para asegurarse de que el centro poco profundo pueda estabilizar el aceite en el pozo central. Si la fase aceitosa se aleja flotando hacia las paredes del marco de la cinta, elimine el aceite y vuelva a realizar el paso de recubrimiento/fijación de la película o haga un nuevo chip si el marco de la cinta ya no es adhesivo. La dimensión del chip es bastante flexible y se recomienda un chip con un portaobjetos de vidrio de 75 mm por 50 mm, un marco de cinta exterior de 50 mm por 50 mm y un marco de cinta interior de 30 mm por 30 mm y una película de cubierta de 56 mm por 56 mm para la inicial. ensayos (Fig. 5a). Como se mencionó, la altura del espacio en el centro para el chip basado en cinta de seis capas es de aproximadamente 600 micrones, lo que se puede estimar aproximadamente por los diámetros exteriores (OD) de ciertas puntas de pipeta, como la punta de 0,57 mm OD utilizada para la carga de gotas en este trabajo. . Puede ser necesario algún ajuste de la altura central reducida de la cámara utilizando menos capas de cinta para gotas más pequeñas. El chip se puede reutilizar hasta que el marco de la cinta ya no sea lo suficientemente adhesivo para mantener una estructura de cámara central poco profunda. Se recomienda cinta superadhesiva de doble cara para chips más duraderos. En su lugar, se podrían usar dos capas de la costosa cámara de sellado del marco de PCR (Bio-Rad, 15 × 15 mm, 65 µL #SLF0601) para hacer el chip de imágenes si cortar una cámara de la cinta de poliimida de seis capas es un problema.

El chip de ensamblaje de centro poco profundo también se puede imprimir en 3D en lugar de fabricarlo con el método de cinta adhesiva anterior. El chip está diseñado por un software en línea gratuito (Tinkercad) e impreso por una popular impresora 3D de resina barata (ELEGOO Mars 2 Pro) con una resina transparente (Siraya Tech Blu 3D Printer Resin Clear V2). El modelo 3D se corta con un software gratuito (CHITUBOX Basic) con un tiempo de exposición de 4 s, un tiempo de exposición inferior de 40 s, una distancia de elevación de 8 mm, una altura de la capa de impresión de 50 µm, una velocidad de elevación de 80 mm/min y una velocidad de retracción de 210 mm/min. . Después de la impresión, el chip se lava con una solución de resina al 25-50 % en alcohol isopropílico (IPA). No se recomienda el lavado con IPA puro porque limpiará en exceso el chip reticulado de forma incompleta y hará que las superficies del chip sean ásperas y menos transparentes. El chip limpio se cura con UV cuatro veces con una exposición de 5 minutos en una caja de curado (ELEGOO Mercury Plus 2 in 1 Washing and Curing Station V2.0) antes de su uso.

Se utiliza una punta de pipeta de orificio redondo tal como se compró (puntas de pipeta de carga de gel VWR®, 1–200 µL, punta redonda, diámetro exterior de 0,57 mm) para aspirar la suspensión de gotas/aceite del recipiente. Luego, la pipeta entrega la suspensión al centro del chip de imágenes a través de una esquina del chip de la película adhesiva levantando ligeramente la película de la cubierta en esa esquina (vea el video en Información de apoyo). Alternativamente, se puede cortar una muesca del marco de la cinta en una esquina para insertar la punta a través de la muesca hasta el centro del chip de formación de imágenes sin levantar la película de cubierta. Se fabrica una entrada de pipeta para el chip impreso en 3D con el mismo propósito. Es importante destacar que, debido a la estructura central poco profunda (altura reducida), la suspensión no fluirá libremente a pesar del aceite humectante. En su lugar, se colocará en el centro del chip de imágenes para obtener imágenes ópticas convenientes con un teléfono inteligente (OnePlus 7 Pro) o un microscopio (Olympus IX71). Las imágenes del microscopio se utilizan para el análisis del tamaño y la uniformidad de las gotas para validar el rendimiento de la generación de gotas de la pipeta. Brevemente, se establece una escala en ImageJ de acuerdo con la barra de escala del microscopio y luego se miden las áreas de proyección de las gotas individuales para calcular el radio de cada gota. Debido a que la altura de la cámara del chip de formación de imágenes es de aproximadamente 600 µm, las gotas más grandes pueden aplanarse un poco cuando se cargan y ensamblan dentro del chip de formación de imágenes, lo que produce áreas de proyección mayores y, posteriormente, radios mayores de lo normal.

Para obtener imágenes de fluorescencia, el chip con gotitas se coloca en un transiluminador de luz azul (Clare Chemical Research) y luego se coloca un filtro ámbar encima del chip de imágenes. La fluorescencia de las gotas se refleja con un teléfono inteligente en condiciones de poca luz u oscuridad después de sintonizar el transiluminador. Si no se dispone de un transiluminador, se recomienda un mini microscopio de fluorescencia portátil asequible (Dino-Lite AM4115T-GFBW) para obtener imágenes de gotas.

Se prepara una mezcla de reacción típica con 5 µL de Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix (New England Biolabs, n.º de catálogo M3019S), 1 µL de cebadores y sondas de GAPDH humana (Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo 4333764 T), 2 µL 10 Solución acuosa de F127 % p/v, 0–10 µL de ARN de control humano diluido (Thermo Fisher Scientific, n.° de catálogo 4,307,281) como objetivo y 12–2 µL de agua libre de nucleasas para obtener un volumen de mezcla total de 20 µL. Los reactivos congelados se derriten en hielo y se mezclan pipeteando antes de su uso y se devuelven al refrigerador inmediatamente después de su uso. La solución acuosa de F127 al 10 % p/v se prepara disolviendo 0,1 g de polvo de F127 (Sigma-Aldrich, BioReagent, n.º de catálogo P2443-250G) en 1 ml de agua fría sin nucleasas (Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo R0582) y el la solución se almacena a 4 °C. Una vez que se completa la mezcla de reacción, se generan gotas uniformes en los tubos de PCR como se mencionó anteriormente. El tubo de PCR con gotitas de mezcla de reacción se coloca inmediatamente en un termociclador portátil (Bio-Rad, MJ Mini Thermal Cycler) para la reacción de PCR con un protocolo de transcripción inversa de 10 min a 52 °C, desnaturalización de 2 min a 95 °C, 40 ciclos de 10 s a 95 °C y 30 s a 60 °C.

La espirulina (ACAp-01003) y el correspondiente kit completo de medios de cultivo (sales + nutrientes, MKAp-00001) son de Algae Research Supply. El medio de cultivo se prepara disolviendo las sales y los nutrientes en cierta cantidad de agua recomendada por el proveedor. Luego, la suspensión de espirulina se diluye con los medios de cultivo a las concentraciones deseadas. La espirulina bien mezclada y los medios de cultivo se dispersan en gotitas pipeteando la generación de gotitas con una punta elíptica deformada por una fuerza de torsión de 20 pulgadas-libra. Después de encapsular el microorganismo, las gotas (cargadas en chips de imágenes basados ​​en cinta de doble cara o en tubos de PCR de 200 μl, junto con el aceite de generación de gotas) se colocan en un alféizar con luz solar para el crecimiento y la proliferación de espirulina. La esquina del chip de imagen y la tapa del tubo de PCR se abren una vez al día durante aproximadamente 1 minuto para el intercambio de gases durante el cultivo de espirulina en gotitas. En estas condiciones, el ciclo de vida de la espirulina es de 2 a 3 semanas.

Para la preparación de microgeles de poliacrilamida, se mezclan 5 µL de solución de monómero y reticulante (acrilamida: bis-acrilamida 29:1, solución al 40 %, Fisher BioReagents, BP1408-1) con 13 µL de agua desionizada y 2 µL de solución de iniciador al 2 % p/v . La solución de iniciador al 2% p/v se prepara disolviendo 10 mg de polvo de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP, Sigma-Aldrich, 900,889-1G) en 500 µl de agua y el tubo que contiene la solución se envuelve en un tubo de aluminio. papel de aluminio y colocado en la oscuridad cuando no esté en uso. La mezcla de precursores de 20 µL resultante se genera en gotitas pipeteando con una punta elíptica deformada por una fuerza de torsión de 20 pulgadas-libra. Además de esta punta de pipeta, otro tipo de punta (punta del microcargador Eppendorf) con tamaño de orificio reducido también se deforma por la misma fuerza y ​​se utiliza para generar gotas de menor tamaño. Las gotitas generadas se transforman en microgeles uniformes después de 2 min de irradiación en una caja UV (Electro-Lite, Electro-Cure 500).

Para la síntesis controlada de microgeles compuestos de poliacrilamida/oro con tapas de oro, la solución se prepara con 10 µL de agua, 5 µL de monómero y solución de entrecruzamiento (Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1, 40% Solution, Fisher BioReagents, BP1408-1 ), 2 µL de solución de iniciador LAP al 2% p/v, 2 µL de solución de citrato de sodio 1 M (Sigma-Aldrich, W302600-1 KG-K) y 1 µL de solución de cloruro de oro 1 M (Sigma-Aldrich, 520,918-1G). Después de mezclar bien, la solución se genera inmediatamente en gotitas pipeteando con una punta elíptica deformada por una fuerza de torsión de 20 pulgadas-libra. El oro recién reducido se precipitará al fondo de cada gota. Diez minutos más tarde, las gotas se entrecruzan para formar microgeles colocándolas en una caja UV durante 2 min. El proceso de gelificación fijará el oro precipitado en su lugar para formar tapas en los microgeles uniformes.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y en la Información complementaria.

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Este trabajo ha sido apoyado por el Fondo Común de los NIH, a través de la Oficina de Coordinación Estratégica/Oficina del Director de los NIH, 4UH3CA241684-03. Los autores reconocen el curso de desarrollo de instrumentación impartido por el Prof. Jeffrey Kantor en la Universidad de Notre Dame.

Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, EE. UU.

Liao Chen, Chenguang Zhang, Vivek Yadav, Angela Wong, Satyajyoti Senapati y Hsueh-Chia Chang

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LC inició, diseñó y llevó a cabo el trabajo. H.-CC asesoró el trabajo. H.-CC y SS adquirieron la financiación y gestionaron el proyecto. CZ contribuyó al esfuerzo de impresión 3D y VY ayudó con el análisis de imágenes de gotas. AW ayudó a probar la PCR digital de gotitas de pipeta cuando era estudiante de ingeniería. LC y H.-CC escribieron el artículo con contribuciones de todos los autores.

Correspondencia a Hsueh-Chia Chang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Chen, L., Zhang, C., Yadav, V. et al. Un kit de formación y creación rápida de prototipos de microfluidos de gotitas de pipeta caseros para PCR digital, encapsulación de microorganismos/células y síntesis controlada de microgeles. Informe científico 13, 184 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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Recibido: 26 mayo 2022

Aceptado: 02 enero 2023

Publicado: 05 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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