La plataforma VersaLive permite el cultivo microfluídico de células de mamíferos para aplicaciones versátiles

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1034 (2022) Citar este artículo

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El cultivo celular basado en microfluidos permite una regulación espacio-temporal precisa del microambiente, imágenes de células vivas y una mejor recapitulación de las condiciones fisiológicas, al tiempo que minimiza el consumo de reactivos. A pesar de su utilidad, la mayoría de los sistemas de microfluidos están diseñados con una aplicación específica en mente y, por lo general, requieren experiencia y equipo especializado para su funcionamiento. Todos estos requisitos impiden que se adopte ampliamente el cultivo celular basado en microfluidos. Aquí, diseñamos e implementamos una plataforma de microfluidos de cultivo celular de perfusión versátil y fácil de usar para múltiples aplicaciones (VersaLive) que solo requieren pipetas estándar. Aquí, mostramos los múltiples usos de VersaLive (p. ej., obtención de imágenes de células vivas con lapso de tiempo, inmunotinción, recuperación celular, lisis celular, transfección de plásmidos) en líneas celulares de mamíferos y células primarias. VersaLive podría reemplazar los formatos de cultivo celular estándar en varias aplicaciones, reduciendo así los costos y aumentando la reproducibilidad entre laboratorios. El diseño, la documentación y los protocolos son de código abierto y están disponibles en línea en https://versalive.tigem.it/.

Los sistemas a microescala se pueden diseñar para adaptarse a los requisitos experimentales que son difíciles de cumplir o totalmente imposibles en el cultivo estándar de células de mamíferos1,2,3. En general, el uso de microfluidos para el cultivo celular permite un control preciso de los factores extrínsecos (p. ej., nutrientes, tratamiento farmacológico, confinamiento de muestras) mientras imita mejor las condiciones fisiológicas4,5,6,7. Gracias a los volúmenes reducidos, la microfluídica permite minimizar el consumo de productos químicos costosos. El mayor grado de control sobre las condiciones experimentales aumenta la fiabilidad de los protocolos en los que el resultado depende más de las habilidades del operador. En los últimos años, por ejemplo, el uso de sistemas de microfluidos se ha mostrado prometedor para facilitar un mejor diagnóstico del cáncer al estandarizar el análisis de biomarcadores inmunohistoquímicos8,9,10. Otras aplicaciones clave recientes de la microfluídica en células de mamíferos son la secuenciación de células individuales de alto rendimiento11,12, la detección de fármacos en paralelo13, la modulación temporal de los tratamientos14 y el control de retroalimentación automatizado de los procesos biológicos15.

Las plataformas microfluídicas suelen estar diseñadas para aplicaciones individuales específicas (p. ej., cultivo celular4, transcriptómica unicelular11, inmunotinción de tejidos fijados9) y, la mayoría de las veces, implican procesos complejos de microfabricación multicapa14,16,17. Kolnik et al. desarrolló una plataforma de microfluidos para imágenes de células vivas que puede estimular dinámicamente las células cultivadas con dos entradas y todas sus proporciones mixtas14. Esta plataforma requiere una fabricación maestra multicapa, utiliza un protocolo complejo de carga de celdas, exige el uso de equipos complementarios (es decir, motores paso a paso, controladores externos) y tuberías de conexión largas, lo que impone volúmenes muertos que superan el volumen real del propio chip microfluídico. . Por otro lado, Gagliano et al. aprovechó un dispositivo de microfluidos autónomo y de una sola capa para aumentar la eficiencia del proceso de reprogramación de pluripotencia de las células somáticas humanas4. Esta plataforma tiene la ventaja de una geometría y fabricación sencillas pero con el inconveniente del único cultivo celular estático que limita las posibles aplicaciones. Tanto Kolnik et al. y Gagliano et al. Las plataformas no están optimizadas para una recuperación sencilla de las células cultivadas.

En este trabajo, diseñamos y desarrollamos un dispositivo de microfluidos versátil, al que llamamos VersaLive, para permitir la aplicación de múltiples protocolos para células de mamífero adherentes que incluyen cultivo celular, inmunotinción, obtención de imágenes de células vivas y recuperación de células mediante el uso de pipetas de laboratorio estándar. Para facilitar la adopción generalizada de VersaLive y la transferencia de protocolos experimentales estándar a la microfluídica, diseñamos VersaLive para que se reproduzca mediante procedimientos de microfabricación simples y para que todas las operaciones en el chip se puedan realizar mediante pipeteo estándar. Demostramos el cultivo de líneas celulares y células primarias y la aplicación de una variedad de protocolos desde la inmunotinción hasta la transfección de plásmidos y la lisis celular.

El dispositivo se muestra en la Fig. 1; consiste en un elastómero permeable al gas (polidimetilsiloxano (PDMS)) fabricado mediante fotolitografía estándar y litografía blanda y adherido a un cubreobjetos de vidrio para microscopía. El dispositivo está diseñado para que solo sea necesario un único paso fotolitográfico para preparar la oblea, lo que permite una replicación rápida y fácil de la tecnología también en laboratorios sin experiencia específica en microfabricación. La fabricación de chips PDMS no requiere alineación de capas y el proceso completo de fabricación puede ser aprendido por personal sin experiencia durante 1 día de capacitación. El material necesario para preparar chips VersaLive se detalla en la Tabla complementaria 1. Como se muestra en la Fig. 1a, la plataforma consta de cinco cámaras de cultivo de 250 µm de ancho. La elección sobre el número de cámaras para colocar en un chip fue dictada por las restricciones de geometría de los depósitos de 3 mm de ancho que deben espaciarse dentro de un cubreobjetos circular de 30 mm y permitir que se corten con un punzón de biopsia. Cada cámara está conectada por un lado a un canal principal común y, por el otro lado, a un canal de entrada independiente. Cada canal de entrada consta de dos canales paralelos de 150 μm de ancho para aumentar la robustez contra la obstrucción de partículas de polvo. Se accede a los canales a través de puertos (Fig. 1a) que actúan como depósitos donde se pueden intercambiar insumos (p. ej., medio de cultivo, fármacos, reactivos). La presión hidrostática por sí sola impulsa el flujo de los puertos a las cámaras, eliminando así bombas, motores o reguladores de presión. Los filtros de células están incrustados en un lado de cada cámara de cultivo para contener las células dentro de la cámara durante la fase de carga evitando que cualquier cosa de más de 5 µm de ancho atraviese el filtro. Una resistencia fluídica de 20 μm de ancho y 6 mm de largo conecta cada cámara de cultivo a sus canales de entrada. La resistencia fluídica adecuada se encontró probando múltiples longitudes del mismo diseño serpentino. La resistencia tiene el propósito de permitir la carga de células en las cámaras en cuestión de segundos desde el llenado del reservorio mientras asegura, una vez que las células se adhieren al portaobjetos de vidrio, la ausencia de tensión de cizallamiento durante la perfusión.

a Diseño del dispositivo de microfluidos con cinco cámaras independientes. Por un lado, todas las cámaras están conectadas al canal principal que se desarrolla desde el puerto A hasta el puerto B de los esquemas. Los fluidos se pueden dirigir a cada cámara de forma independiente mediante puertos dedicados (puertos n.° 1 a n.° 5 en los esquemas). La resistencia de flujo serpenteante evita el esfuerzo cortante en las celdas durante las operaciones del dispositivo. b, c Modos de operación de VersaLive y sus simulaciones de elementos finitos en el software COMSOL Multiphysics (recuadro discontinuo). En el modo de entrada única de "perfusión" (b), el canal principal se aprovecha para entregar el mismo medio a todas las cámaras al mismo tiempo. El modo de entrada múltiple (c) aprovecha los puertos dedicados para entregar diferentes entradas (es decir, medios, productos químicos) a cada cámara, evitando contaminaciones cruzadas. d Durante la carga de celdas, la suspensión de celdas fluye a través del canal principal hacia las cámaras. Una vez en la cámara, las células se ralentizan y, finalmente, son detenidas por las características del filtro, como se prevé en el perfil de velocidad de la simulación. Barra de escala, 150 µm. e Se observó que la evaporación del solvente en los reservorios aumenta la concentración de soluto del contenido del canal durante la perfusión. El efecto se eliminó por completo mediante la adición de una capa de aceite mineral en los depósitos. En la gráfica se reporta una sola corrida representativa.

Todas las operaciones en VersaLive se llevan a cabo simplemente pipeteando el contenido dentro y fuera de los puertos que actúan efectivamente como depósitos. VersaLive se puede operar de dos maneras: modo de entrada única, donde la misma entrada (p. ej., medio de crecimiento celular) se entrega a todas las cámaras de células (Fig. 1b) o el modo de entrada múltiple, donde una entrada diferente puede ser entregado a cada una de las 5 cámaras (Fig. 1c). El modo de entrada única se configura pipeteando un volumen de hasta 20 μL en el depósito conectado al canal principal (puerto A en la Fig. 1b) mientras se dejan todos los demás depósitos vacíos. Nos referimos a esta configuración como el modo de entrada única de "perfusión", ya que estará presente un flujo constante desde el depósito lleno hasta las cámaras de las celdas. Se obtiene una variante del modo de entrada única si todos los depósitos se llenan con el mismo volumen. En este caso, no habrá flujo presente en el dispositivo, dando lugar a un cultivo celular estático. Este modo de operación de entrada única "estático" es particularmente conveniente durante la fase de adhesión celular, cuando las células no están completamente unidas al chip y un flujo correría el riesgo de desplazarlas.

En el caso del modo de entrada múltiple, todos los depósitos de entrada se llenan mientras que los puertos del canal principal se dejan vacíos (Fig. 1c). Esta configuración crea un flujo activo a través de cada cámara que es lo suficientemente fuerte como para evitar el reflujo del canal principal, pero lo suficientemente lento como para evitar el esfuerzo cortante en las celdas (Fig. 2a). Verificamos que un volumen de 20 μL por cámara será suficiente para al menos 24 h de perfusión constante en una incubadora de células. El modo de entrada múltiple es aplicable, por ejemplo, cuando es necesario analizar en paralelo diferentes concentraciones de una molécula pequeña o un anticuerpo, como para la detección de drogas o la inmunotinción.

Se expusieron células CHO-K1 en las cámaras indicadas a tratamiento con tunicamicina (0,5 μg/mL durante 20 h) y se midió la respuesta integrada al estrés mediante la intensidad de la fluorescencia CHOP::GFP. La tercera fila muestra la rodamina B que se usó como rastreador de flujo para verificar el flujo adecuado en la plataforma durante la adquisición de lapso de tiempo. Barra de escala, 150 µm. b Evolución temporal de la fluorescencia media de CHO::GFP en las células de las cámaras n.° 1, n.° 2, n.° 3, n.° 4 (resolución temporal de 15 min). c La cuantificación de una sola célula de la fluorescencia CHO::GFP de las imágenes informadas en un arrojó una diferencia de 15 veces entre las muestras tratadas y no tratadas. Los puntos representan celdas individuales (n = 38 en el n.° 1, n = 28 en el n.° 2, n = 49 en el n.° 3, n = 55 en el n.° 4, n = 24 en el n.° 5) mientras que las barras negras son valores medianos.

Se utilizó el software COMSOL Multiphysics para simular cada modo de operación (Métodos), para calcular los perfiles de velocidad resultantes cuando se aplican diferencias realistas de presión hidrostática en el chip, como se muestra en las inserciones discontinuas (Fig. 1b, c).

Independientemente del modo de operación elegido, las células siempre se cargan en las cámaras utilizando el modo de entrada única de "perfusión", como se muestra en la Fig. 1d. Se utilizó la adquisición de lapso de tiempo del paso de carga celular para estimar la velocidad de carga celular de las células HeLa, que resultó ser de 150 µm por segundo en la entrada de la cámara; luego toma 5 segundos adicionales para viajar 150 µm antes de finalmente detenerse contra el filtro, en línea con el perfil de velocidad obtenido en las simulaciones y que se muestra en la Fig. 1b, c. Aunque las células se siembran inicialmente más cerca de los postes, posteriormente forman una monocapa uniforme que eventualmente cubre la superficie de la cámara. El número inicial de celdas para cargar en las cámaras puede variar según el tipo de celda y los requisitos experimentales (p. ej., tamaño de celda, duración del experimento, cobertura de celda, cronogramas, necesidad de una monocapa, características de la línea celular). La tasa de carga de células en una cámara se puede ajustar fácilmente variando la concentración de suspensión celular. Sin embargo, para evitar la adhesión de las células a regiones del chip distintas de las cámaras (p. ej., canal principal, depósitos), es preferible ajustar la concentración de células para mantener el tiempo de carga corto, es decir, dentro de unos pocos minutos. En nuestros experimentos, observamos que para llevar a cabo la carga de un chip completo en pocos minutos, la concentración celular óptima para células HeLa oscilaba entre 1000 y 5000 células por microlitro.

Expuesto al ambiente externo, el pequeño volumen de los reservorios tiende a evaporarse con el tiempo incluso si se mantiene en una incubadora de células, como se muestra en la Fig. 1e. Este efecto, sin embargo, puede eliminarse pipeteando 2,5 μL de aceite mineral a los depósitos, como se muestra en la Fig. 1e, donde se observó un aumento con el tiempo de la concentración de soluto en el depósito en ausencia de aceite, pero completamente abolido en su presencia.

Validamos la capacidad de la plataforma de microfluidos para entregar entradas químicas independientes a cada una de las cinco cámaras de cultivo por medio de una línea celular CHO-K1 marcada con CHOP::GFP18. CHOP es un factor de transcripción cuya expresión es inducida por la activación de la vía de respuesta integrada al estrés (ISR) y al estrés del retículo endoplásmico (RE). Las células se cargaron en las cámaras y se mantuvieron durante la noche en una incubadora con el modo estático de entrada única en medio de crecimiento estándar para garantizar la adhesión celular a la superficie de vidrio. Al día siguiente, todos los reservorios se vaciaron pipeteando y el chip se cambió al modo de operación de múltiples entradas agregando medio nuevo a los reservorios conectados a las cámaras n.° 2 y n.° 4, mientras que la tunicamicina, disuelta en medio fresco (0,5 µg/ml), se añadió a la cámara n.° 1, n.° 3 y n.° 5, como se muestra en la Fig. 2a. La tunicamicina es un potente inductor del estrés del RE al bloquear la N-glicosilación de proteínas y, por lo tanto, debería inducir la expresión de CHOP::GFP en las células informadoras. A continuación, se colocó el chip VersaLive en un microscopio de fluorescencia invertido y se tomaron imágenes de cada cámara durante 20 h a intervalos de 15 min. Como se muestra en la Fig. 2a-c, al final del tratamiento, solo las células expuestas a tunicamicina expresaron CHOP::GFP, lo que confirma que no hay flujo cruzado entre las cámaras. Además, como verificación adicional del correcto funcionamiento del dispositivo y la ausencia de flujo cruzado, agregamos rodamina B al depósito de entrada de la cámara #3. Este colorante rojo fluorescente no tiene efectos tóxicos sobre las células. Como era de esperar, la fluorescencia roja se detectó solo en la salida de la cámara n.° 3, pero estuvo ausente en las otras cuatro cámaras. La expresión de CHOP::GFP a lo largo del tiempo se informa en la Fig. 2b y muestra una expresión apreciablemente más alta en las muestras tratadas ya después de 8 h de exposición a la tunicamicina. Para cuantificar la diferencia en el estrés de ER entre las cámaras, se analizó el último momento del tratamiento con resolución de una sola célula. La exposición a tunicamicina de 20 h resultó en un aumento de 15 veces en la expresión de CHOP :: GFP (Fig. 2c).

Los modos de operación de entrada única y múltiple se pueden aprovechar para implementar cualquier protocolo de interés, como la entrega de agentes fijadores (p. ej., paraformaldehído) y anticuerpos marcados directamente a las células. Los pasos de lavado y tinción de los protocolos de inmunotinción establecidos se pueden replicar con la ventaja de un consumo efectivo de reactivo por debajo de un microlitro, la ganancia de señal debido a la perfusión y la duración del protocolo reducida de horas a minutos. Para mostrar esta posibilidad, realizamos la inmunotinción del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) en dos líneas celulares de cáncer de mama (AU565 y HCC38 como control negativo). HER2 es una proteína de membrana y se sobreexpresa en algunas formas de cáncer de mama, y es un biomarcador clínicamente relevante para el diagnóstico de cáncer de mama. Las células cancerosas que expresan HER2 (HER2+) son más proliferativas pero tienen un mejor pronóstico, mientras que las que no expresan HER2 (HER2-) son más resistentes a la quimioterapia citotóxica19. Por ello, la discriminación entre estos dos tipos de tumores es importante para decidir la estrategia terapéutica a llevar a cabo. En este caso, se utilizaron las líneas celulares de cáncer de mama HER2+ (AU565) y HER2− (HCC38) para validar el protocolo de inmunofluorescencia en VersaLive. Los dos tipos de células se cultivaron en dos chips VersaLive diferentes, se fijaron químicamente y se marcaron con fluorescencia mediante inmunotinción anti-HER2 directamente en el dispositivo. Como se muestra en la Fig. 3a, b, la inmunotinción en el chip fue específica del tipo de célula y dio como resultado la localización correcta en la membrana del receptor HER2. Tras el análisis cuantitativo, es posible apreciar que la tinción durante 10 min en VersaLive resultó en una intensidad 12 veces mayor en comparación con el método tradicional en portaobjetos. Curiosamente, solo se aprecia una pequeña diferencia en la intensidad cuando los portaobjetos se incuban durante 1 h en lugar de 10 min. Asociamos este aumento en la intensidad de la señal y la calidad de la imagen a la perfusión, que permite la acumulación de anticuerpos marcados, por lo tanto, señal, a lo largo del tiempo. Esta acumulación no es posible en los protocolos tradicionales.

a, b Inmunofluorescencia en chip del receptor de membrana HER2 en células AU565 (a, control positivo) y células HCC38 (b, control negativo). Barra de escala, 150 µm. c Comparación de las intensidades de la señal IF para la tinción de inmunofluorescencia en VersaLive y en portaobjetos utilizando un protocolo estándar. En comparación con los protocolos de portaobjetos estándar, IF en VersaLive dio como resultado un aumento de 10 veces en la señal al tiempo que acortaba el tiempo de proceso y disminuía el consumo de reactivos. Las barras negras representan los valores medianos de ROI individuales (puntos grises, n = 8). d, e Cultivo de células primarias de epitelio pigmentado de retina (RPE) de ratón. Fijación química e inmunotinción en el chip, marcaje de citrato sintasa (verde), actina f (roja) y núcleos celulares (azul). Las células RPE pudieron adherirse al chip mientras conservaban su pigmento oscuro característico. Barra de escala, 30 µm. f Transfección de plásmido en chip de células HeLa, cámara n.º 1 a cámara n.º 5 (chn.º n) del mismo chip. Eficiencia de transfección de 25,3 ± 8,8% (media ± sd, n = 5). Barra de escala, 150 μm.

Los cultivos de células primarias de pacientes son de gran importancia para el diagnóstico de enfermedades o con fines de investigación, para estudiar células primarias de modelos animales. VersaLive puede ser una poderosa herramienta para manipular y cultivar células primarias. Como ejemplo, cultivamos células primarias recolectadas de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) de ratón para demostrar la posibilidad de cultivar células primarias en VersaLive. Las células RPE recuperadas de tejido fresco pudieron adherirse a la superficie de vidrio del chip y crecer mientras conservaban su pigmento oscuro característico (Fig. 3d, e).

Sin embargo, nos gustaría señalar que VersaLive no es adecuado para capturar células raras. Con este propósito, se han desarrollado diferentes sistemas microfluídicos para aislar y concentrar tipos específicos de células a partir de una muestra a granel según, por ejemplo, su fenotipo20.

La transfección liposomal es un método químico bien establecido para introducir genes en las células. El interés por los productos de la expresión de estos genes puede abarcar desde lo fundamental hasta las ciencias médicas o para aplicaciones industriales21. Se demostró que la microfluídica es una herramienta útil para aumentar el rendimiento de las células transfectadas y minimizar el consumo de reactivos22. Sin embargo, los trabajos anteriores que explotaban los beneficios de la perfusión aún requerían sistemas de bombeo y tuberías externas para introducir productos químicos en los chips22,23. La necesidad de hardware adicional aumenta el costo por experimento y el uso de tubos inevitablemente agrega volumen muerto, lo que significa que una fracción de los reactivos usados no se usará para la transfección real sino que se perderá en el proceso. VersaLive no tiene volúmenes muertos porque no requiere tubos ni un sistema de bombeo externo. De hecho, cualquier cantidad de mezcla de transfección que quede en los depósitos al final del paso de perfusión se puede recuperar para otra transfección en el chip.

Implementamos un protocolo para la transfección de plásmidos de ADN en chip en VersaLive adaptando la transfección de reactivos basados en lípidos en placas de 96 pocillos para trabajar en chip. A partir de un cribado en placa de 96 pocillos, determinamos la mezcla de transfección más adecuada de ADN y concentraciones de complejo lipídico. Se encontró que la combinación óptima fue de 300 ng de ADN y 0,5 μL de reactivo de transfección (Métodos). Para la transfección en el chip, el ADN y los lípidos se diluyeron con medio de crecimiento celular hasta un volumen final de 50 μL. Se usaron alícuotas de esta mezcla de transfección madre para perfundir las células durante 2 h en modo de entrada múltiple con un consumo efectivo de reactivo del orden de unos pocos microlitros por cámara. En la Fig. 3f, mostramos el resultado de la transfección de células con un plásmido que expresa un indicador fluorescente mCherry aguas abajo de un promotor de CMV, obteniendo una eficiencia de transfección del 25,3 % ± 8,8 por cámara. Luego comparamos la eficiencia de transfección entre VersaLive y la placa estándar de 96 pocillos utilizando el mismo protocolo de transfección inversa. La eficiencia de transfección medida en una placa de 96 pocillos (27,2 ± 4,6 %) y, por lo tanto, comparable a VersaLive.

El recubrimiento de la superficie antes de la siembra de células es beneficioso o, para algunos tipos de células, es necesario (p. ej., cultivos sin suero). VersaLive es totalmente compatible con cualquier solución de recubrimiento de baja viscosidad (p. ej., poli-L-lisina, vitronectina, fibronectina). Como ejemplo de cultivo celular en VersaLive con recubrimiento, realizamos imágenes de células vivas de la tubulación de endosomas cargados de transferrina en células HK2 en chips VersaLive recubiertos con una solución de vitronectina en PBS (Película complementaria 1).

Dependiendo de las líneas celulares estudiadas, la tensión de cizallamiento puede ser un parámetro que debe minimizarse o explotarse cuando se cultiva bajo flujo. En todos los experimentos mostrados en este trabajo, el interés estaba en minimizar la tensión de cizallamiento en las células, por lo tanto, todas las presiones utilizadas en los protocolos cumplen con este requisito. Sin embargo, VersaLive también es adecuado para estudios en los que el esfuerzo cortante es un requisito previo. Colocando depósitos externos a diferentes alturas, es posible regular fácilmente la presión del caudal aplicado. Por ejemplo, al colocar los depósitos 10 cm por encima del chip, fue posible aplicar un flujo de 10 mbar en las células HeLa, lo que hizo que las células se eliminaran de la cámara de cultivo (Película complementaria 2).

VersaLive permite el acceso directo a las células mediante la eliminación completa del PDMS del portaobjetos de vidrio donde está unido de forma reversible (Fig. 1a, b complementarias). Prevemos que esta característica sea útil para la reposición de placas de células, la secuenciación de células y todas las aplicaciones que requieren una recuperación completa de la muestra. Para demostrar que la operación de eliminación de PDMS no daña las células, se adquirió el mismo campo de visión en imágenes en vivo y para la muestra fijada químicamente, después de la eliminación de PDMS (Fig. 1c, d complementaria). Además, VersaLive se puede utilizar para recuperar el contenido de la cámara de forma selectiva y precisa. En la figura complementaria 2a-f, informamos la secuencia de operaciones en VersaLive para lisar selectivamente el contenido de cada cámara, desde la cámara n.º 1 hasta la cámara n.º 5. Usando el protocolo descrito, es posible recolectar los lisados de la cámara en puertos separados, eliminando cualquier riesgo de contaminación cruzada. Al vaciar un depósito a la vez o todos a la vez, este mismo protocolo es adecuado para una recuperación de contenido secuencial o paralela.

Las operaciones informadas en la figura complementaria 2a-f se llevan a cabo utilizando soluciones teñidas para resaltar las rutas de flujo. Para demostrar el correcto funcionamiento de este protocolo, se recolectó el ARN de las células de cada cámara, se preparó una biblioteca de secuenciación y se analizó su calidad con el instrumento TapeStation para determinar su distribución de tamaño (Fig. 2g complementaria). Los datos muestran que el ARN se recuperó con éxito de todas las cámaras, a pesar de algunas diferencias en la cantidad de ARN extraído.

VersaLive ofrece una plataforma de microfluidos fácil de adoptar para células de mamíferos, permite elegir entre perfusión y cultivo celular estático sin requerir ningún componente externo para funcionar. VersaLive también permite el acceso directo a las células cultivadas con la ventaja de reducir el consumo de reactivos y material de plástico. Los protocolos adicionales se pueden adaptar fácilmente a VersaLive ajustando las concentraciones utilizadas en el sistema de cultivo macroscópico, con la ventaja adicional de reducir costos y acelerar las reacciones.

En comparación con el cultivo celular en placas de múltiples pocillos, VersaLive tiene varias ventajas pero también algunas limitaciones que se resumen esquemáticamente en la Tabla 1. VersaLive reduce el consumo de reactivos y de material plástico de laboratorio en comparación con el cultivo celular en placas de múltiples pocillos. En general, esto se traduce en una disminución del costo por experimento. Además, VersaLive le brinda al usuario la posibilidad de decidir si procede con un cultivo celular estático tradicional, similar a las placas de múltiples pocillos, o si implementa un cultivo celular de perfusión, como ocurre con las configuraciones comerciales más costosas y voluminosas. La implementación del cultivo celular estático en VersaLive, o en los sistemas de microfluidos en general, imita mejor las condiciones fisiológicas para el crecimiento celular debido a los volúmenes reducidos, incluso en comparación con los formatos de múltiples pozos (p. ej., aumento en la concentración de factores secretados, restricciones geométricas optimizadas) , ventajas que no se pueden lograr en el cultivo celular en placa de múltiples pocillos. El cultivo de células de perfusión tiene un conjunto de ventajas sobre los métodos de cultivo estáticos, como implementar un flujo continuo de nutrientes para evitar el agotamiento con el tiempo; mantener una concentración constante de un fármaco o molécula pequeña a lo largo del tiempo; y acelerar los protocolos estándar.

Algunas de las limitaciones actuales de VersaLive son su bajo rendimiento con hasta cinco cámaras por chip, que sin embargo podría ampliarse usando la misma topología pero aumentando la longitud del canal principal y, por lo tanto, la cantidad de cámaras conectadas a él. Además, la capacidad de retención de los filtros celulares es efectiva solo para células mayores de 5 μm de diámetro, mientras que la duración máxima del experimento sin la intervención de un operador es de unas 24 h. Sin embargo, es posible ampliar la duración de un experimento mediante el uso de puntas de pipeta conectadas a los depósitos para aumentar la capacidad de volumen. A pesar de estas limitaciones, creemos que VersaLive proporciona un punto de entrada único de baja barrera para los laboratorios interesados en adoptar la microfluídica en sus actividades de cultivo de células de mamíferos. De hecho, aunque hay muchos dispositivos de microfluidos que se pueden usar para realizar los protocolos individuales aquí descritos, hasta donde sabemos, ninguno de estos dispositivos fue diseñado para aplicaciones multipropósito basadas en pipetas. Como tal, VersaLive ofrece una ventaja única para aquellos investigadores que deseen beneficiarse de las ventajas del cultivo celular microfluídico pero que se hayan desanimado por la complejidad, el costo del equipo necesario y la experiencia requerida. Creemos que VersaLive puede ayudar a "democratizar" los microfluidos para células de mamíferos, contribuyendo así a aumentar la replicabilidad experimental y minimizando el uso de reactivos.

La tecnología VersaLive es de código abierto y todos los protocolos y materiales están disponibles en línea (https://versalive.tigem.it/).

La plataforma microfluídica VersaLive se diseñó con Autodesk Fusion 360. El perfil de velocidad del chip se modeló con el método de elementos finitos (COMSOL Multiphysics 5.4). En los modos de utilización simulados (Fig. 2), se aplicaron 0,5 mbar de presión en cada entrada mientras que las salidas se configuraron a presión cero. Se eligió este valor de presión porque equivale a los 5 mm de presión hidrostática cuando los reservorios se llenan al máximo de su capacidad volumétrica. La dirección del flujo en las parcelas de simulación se indicó mediante flechas cuyas dimensiones reflejan la magnitud de la velocidad en una escala logarítmica. Se exportó un modelo CAD 2D del chip a Autodesk AutoCAD 2020 para diseñar la máscara de fotolitografía imprimible.

Los chips de microfluidos se fabricaron utilizando una combinación de procedimientos estándar de fotolitografía y litografía blanda24. El molde maestro fue microfabricado mediante fotolitografía de máscara de fotorresistencia negativa SU-8 (SU-8 3035, Kayaku Advanced Materials Inc.) sobre sustrato de oblea de silicio. La fotoprotección se revistió por rotación para alcanzar un espesor final de 25 µm y se procesó siguiendo las directrices del fabricante. La altura de la característica se confirmó mediante la medición mediante microscopía óptica de la sección transversal de una réplica de silicona de los canales. Antes del primer uso del master, se requiere la pasivación de su superficie para facilitar el paso de liberación durante la litografía blanda. El maestro se pasiva por deposición de vapor de perfluorosilano (1H,1H,2H,2H-perfluorooctil-triclorosilano, Merck kGaA). Específicamente, el maestro se colocó en un desecador con un pequeño vial que contenía 20 µL de perfluorosilano. Luego se aplicó vacío durante la noche para permitir que el perfluorosilano se evaporara y reaccionara con la superficie de la oblea de silicio, formando un recubrimiento superhidrofóbico unido covalentemente. A continuación, el maestro pasivado se utilizó como molde para la parte de litografía blanda del proceso de fabricación del dispositivo de microfluidos. La plataforma microfluídica VersaLive está formada por un elastómero de silicona (PDMS) adherido a un portaobjetos de vidrio. La base de elastómero del PDMS se mezcló a fondo con el agente de curado en una proporción de 10:1 como se indica en la hoja de datos del fabricante (Sylgard 184, Dow Corning). Se eliminaron las burbujas de aire del polímero sin curar aplicando vacío a la mezcla durante 2 horas o hasta que no se observaron burbujas. A continuación, la mezcla se vertió sobre el molde maestro hasta obtener un espesor final de unos 5 mm. Si fue necesario, se aplicó vacío por segunda vez para eliminar las burbujas formadas durante el paso de vertido. Luego, el molde con el PDMS sin curar se colocó en un horno a 80 °C durante un mínimo de 2 h para acelerar la reticulación de la mezcla de polímeros. Una vez curado, el PDMS se despegó del molde maestro. A continuación, se colocó la losa de PDMS con las características del patrón hacia arriba para cortar los chips individuales. De manera similar, los puertos de acceso se abrieron utilizando un sacabocados de biopsia de 3 mm (ref. 504649, World Precision Instruments). Los canales de los chips de PDMS se sellaron mediante unión por plasma de los chips a un portaobjetos de vidrio redondo (30 mm de diámetro, grosor n.º 1, Marienfeld). Los portaobjetos de vidrio y los chips PDMS primero se limpiaron de partículas de polvo con cinta adhesiva. Para la activación superficial de portaobjetos de vidrio y chips PDMS, se utilizó plasma de aire de 85 W a 0,4 mbar o inferior (ZEPTO versión B, Diener electronic GmbH & Co. KG). Para las uniones permanentes o reversibles se utilizaron 30 o 10 segundos de plasma de aire, respectivamente. A continuación, el chip se colocó en un tubo de lente de aluminio (SM30L05, ThorLabs) utilizado como soporte del chip. El tubo de la lente permitió la transferencia segura del chip durante el flujo de trabajo experimental (p. ej., banco de trabajo, incubadora, microscopio). Para permitir un procedimiento de adquisición de imágenes fácil y confiable, el microscopio Nikon se equipó con un soporte personalizado para los tubos de lentes hecho de acrílico cortado con láser de 2 mm.

HeLa WT, junto con las líneas celulares de cáncer de mama AU565 y HCC38 se adquirieron de ATCC y se cultivaron en medio celular RPMI 1640 (sin L-glutamina, EuroClone). Se cultivaron células indicadoras CHO-K1 (amable regalo del Prof. David Ron) 18 en medio celular F-12 (Gibco). Ambos medios celulares se suplementaron con suero bovino fetal al 10 % (FBS, EuroClone), L-glutamina al 1 % (EuroClone) y penicilina-estreptomicina al 1 % (EuroClone).

La línea de células epiteliales del túbulo proximal humano (HK2) se adquirió de ATCC (#CRL-2190). Las células HK2 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco/F12 (DMEM/F12, Gibco) suplementado con FBS al 5%, L-glutamina 2 mM, 1 U/ml de antibióticos (penicilina/estreptomicina) e insulina-transferrina-selenio al 1% ( ITS-Sigma Aldrich).

Las células se mantuvieron en una incubadora de células a 37 °C, 100 % de humedad y 5 % de atmósfera de CO2. Antes de cargar un dispositivo de microfluidos, se recogió el contenido de un matraz T25 con una confluencia del 90 % según el siguiente procedimiento. En primer lugar, se eliminó el medio celular en uso y se enjuagaron las células con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio (PBS, EuroClone). Para separar las células del matraz, se añadieron 0,5 ml de tripsina-EDTA al 0,05 % (Gibco) y el matraz se volvió a colocar en la incubadora durante dos minutos. Para desactivar la tripsina, se añadieron 2 ml de medio celular al matraz y las células se mezclaron completamente hasta que se eliminaron todos los agregados visibles. La suspensión de células resultante se usó directamente para la carga en el chip. El epitelio pigmentario de retina de ratón primario (EPR) fue un obsequio de Sabrina Carrella, PhD (TIGEM) y se obtuvo como se describió anteriormente25.

El tratamiento con plasma utilizado para la unión del PDMS al vidrio también proporciona una hidrofilia temporal a la superficie de los canales24,26. Una superficie de canal hidrófila es clave para permitir que cualquier solución a base de agua fluya hacia los microcanales (es decir, se humedezca). Para optimizar el flujo de trabajo de fabricación de un lote de chips, el proceso de humectación se llevó a cabo unos minutos después del procedimiento de unión. Para la humectación de los canales de microfluidos, se agregaron 10 µL de PBS en el puerto B del chip hasta que se llenaron todos los canales. Si era necesario, todos los puertos se llenaron con 10 µL de PBS y el chip se colocó en un desecador y se aplicó vacío durante 15 minutos o hasta que desaparecieron todas las burbujas de aire. Para el almacenamiento a largo plazo (4 a 6 semanas), todos los depósitos del chip se llenaron con 20 µL de PBS, el lado PDMS de los chips se selló con cinta de oficina (Scotch Magic Tape, 3 M) y los chips se mantuvieron a + 4 °C hasta su uso.

Para cargar las células, el PBS utilizado para humedecer los canales se extrae de todos los depósitos y se añaden 10 µL de suspensión celular (1–5 × 106 células/mL) al puerto B del dispositivo. Al llenarse el depósito, las células inmediatamente comienzan a fluir a través del canal principal y entran en las cámaras (Fig. 2b). Cuando una cámara determinada se llena con el número adecuado de células, se agregan 10 μl de medio celular al puerto respectivo para disminuir la velocidad de flujo a través de esa cámara. Cuando todas las cámaras están llenas de células, se agregan 20 µL de medios celulares al puerto A y se vacía el puerto B para lavar el canal principal de las células no deseadas. Luego, el puerto B se enjuaga de las células residuales y se llena con 20 µl de medio celular. A continuación, todos los puertos de entrada del n.° 1 al n.° 5 se llenan hasta un volumen final de 20 µl de medio celular fresco. Un volumen igual de medios celulares en todos los puertos evita la formación de caídas de presión en el chip y permite el cultivo celular estático. Finalmente, se añaden 2,5 µL de aceite mineral para cultivo celular (M8410, Merck kGaA) a cada depósito para evitar la evaporación de su contenido. Los chips permanecieron en la incubadora durante la noche a 37 °C, 100 % de humedad y 5 % de atmósfera de CO2 antes del comienzo de los experimentos. Los resultados de las operaciones de humectación y carga de células se comprobaron utilizando un estereomicroscopio invertido (Leica Microsystems).

Las adquisiciones de lapso de tiempo de células CHO-K1 se adquirieron a través de un microscopio Nikon Ti Eclipse equipado con una lámpara de mercurio (Intensilight, Nikon), una cámara digital EMCCD (iXon Ultra 897, Andor Technology Ltd) y una cámara de incubación (H201-OP R2, Okolab). Antes del montaje del chip, la incubadora se equilibró a una temperatura de 37 °C y aire humidificado con 5% de CO2. Se adquirieron adquisiciones de lapso de tiempo de hasta 20 h utilizando un objetivo de aire ×40 (CFI Plan Fluor DLL ×40, 0.75 NA, Nikon Instruments) para recolectar la señal más alta posible. Sin embargo, debido a la posición descentrada de la cámara #5 en este dispositivo específico, la adquisición de esta cámara con este objetivo no se pudo lograr en nuestro microscopio. Para el análisis de una sola célula, se adquirió la fluorescencia de las células de todas las cámaras al final del tratamiento de 20 h utilizando un objetivo de aire ×20 (CFI Plan Fluor DLL ×20, 0.5 NA, Nikon Instruments). Dependiendo del experimento, las imágenes se recolectaron en contraste de fase (PC) y epifluorescencia para longitudes de onda verde, roja y amarilla utilizando los tiempos de exposición y los conjuntos de filtros respectivamente informados en la Tabla 2.

Después de sembrar durante la noche, los chips VersaLive con células CHO-K1 en cultivo estático se retiraron de la incubadora. A cada chip se le vaciaron los depósitos A y B. A continuación, se renovó el contenido de los depósitos n.° 2 y n.° 4 con 15 µl de medio de células F12 fresco. Luego, el contenido de los reservorios #1, #3 y #5 se reemplazó con 15 µL de tunicamicina 0.5 µg/mL en medio celular F12. Luego, se añadió 1 µL de sulforhodamine B 0.1 mg/mL (Merck kGaA) al depósito #3 como trazador de flujo. A todos los depósitos llenos (#1 a #5), se añadieron 2,5 µL de aceite mineral para cultivo celular para evitar su evaporación. Los depósitos A y B quedaron vacíos. Luego, el chip se montó en el microscopio para obtener imágenes de células vivas durante una adquisición de lapso de tiempo de 20 h a intervalos de 15 min entre cada adquisición.

Para cuantificar la respuesta al estrés de las células CHO-K1 tratadas y no tratadas con tunicamicina, se analizaron imágenes de microscopía de células vivas utilizando el complemento Trainable WEKA Segmentation27 en el software ImageJ. En resumen, el software fue entrenado para distinguir células CHO dentro de las cámaras de cultivo de VersaLive. El mapa de probabilidad devuelto por el software se umbralizó para convertirlo en una máscara segmentada. Luego, la máscara se superpuso a la imagen original. Las intensidades medias de las células individuales resultantes se utilizaron para cuantificar su respuesta al estrés.

Las líneas celulares de cáncer de mama AU565 y HCC38 se cargaron en chips VersaLive y se cultivaron durante la noche en cultivo celular estático como se describe en una sección anterior de este trabajo. Para la fijación química en el chip, después de retirar el medio celular, todos los puertos se lavaron con 20 μL de PBS. Las células se perfundieron en modo de entrada múltiple con paraformaldehído (PFA, 4 % p/v en PBS) durante 10 min. A continuación, todos los puertos se lavaron dos veces con 20 μL de PBS seguido de 5 min de perfusión de PBS en modo de entrada múltiple. Para extinguir la fluorescencia de PFA, se perfundió una solución de bloqueo (NH4Cl 50 mM; BSA al 0,5 % en PBS) en modo de entrada múltiple durante 30 min. Finalmente, todos los puertos se lavaron con 20 μL de PBS. Para la inmunotinción en el chip, se perfundió el anticuerpo anti-HER2 (BB700 Mouse Anti-Human Her2/Neu, BD OptiBuild) diluido 1:100 en tampón de bloqueo en entrada múltiple durante un tiempo definido por el experimento (10 o 30 min) . Luego, todos los puertos se lavaron dos veces con 20 μL de PBS. Para preservar la muestra, todos los puertos se llenaron con 20 μL de PBS y 2,5 μL de aceite mineral para cultivo celular para evitar la evaporación. Las muestras se almacenaron a 4 °C.

Las líneas celulares de cáncer de mama AU565 (ERBB2+, control positivo) y HCC38 (ERBB2−, control negativo) se sembraron con una confluencia del 60-70 % en cubreobjetos de vidrio (EXACTA-OPTECH, área 10 × 10 mm2, grosor 0,13-0,16 mm) en 24 -buen plato.

Después del lavado con PBS 1x, las células se fijaron con PFA al 4% durante 10 min y luego se lavaron con PBS 1x. Después de la fijación, las células se bloquearon con tampón de bloqueo, preparado con BSA al 0,5 % (Sigma-Aldrich) y NH4Cl 50 mM (Sigma-Aldrich) en PBS 1x, durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Las células se incubaron en un entorno húmedo a TA en la oscuridad con 1:100 de anticuerpo primario (antihumano-ERBB2 Ab de ratón conjugado con BB700, BD Bioscience). El tiempo de incubación se fijó de acuerdo con el plan experimental. El anticuerpo primario se preparó en tampón de bloqueo.

Después de la incubación del anticuerpo, las células se lavaron tres veces con PBS 1x y una vez más con ddH2O. Luego, los cubreobjetos se montaron en Fluoroshield™ con DAPI (Sigma-Aldrich) y las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio Nikon Ti Eclipse equipado con una lámpara de mercurio (Intensilight, Nikon), una cámara digital EMCCD (iXon Ultra 897, Andor Technology Ltd) y un objetivo aéreo ×20 (CFI Plan Fluor DLL ×20, 0.5 NA, Nikon Instruments).

Las células RPE primarias de ratón se cargaron en chips VersaLive y se dejaron adherir a la superficie del chip de microfluidos durante la noche en un cultivo celular estático, como se describe en una sección anterior de este trabajo. La fijación química en el chip se llevó a cabo como se describió anteriormente para las líneas celulares de cáncer. La inmunotinción en chip se inició perfundiendo durante 10 min el tampón de permeabilización (0,3 % Triton X-100, 5 % FBS en PBS) en modo de entrada múltiple. A continuación, se perfundió el anticuerpo primario anti-citrato sintasa (ab96600, Abcam) en tampón de bloqueo (BSA al 0,5 %, saponina al 0,05 %, NH4Cl 50 mM, NaN3 al 0,02 % en PBS) en modo de entrada múltiple durante 10 min. Luego, todos los puertos se lavaron con 20 μL de PBS. Sucesivamente, se perfundieron Alexa Fluor 488 (A-21206, Thermo-Fisher Scientific), Alexa Fluor 568 faloidina (A-12380, Thermo Fisher Scientific) y DAPI (D1306, Thermo Fisher Scientific) anti-conejo de burro marcados con fluorescencia durante 10 min en modo de entrada múltiple para teñir mitocondrias, f-actina y núcleos, respectivamente. Luego, todos los puertos se lavaron dos veces con 20 μL de PBS. Para preservar la muestra, todos los puertos se llenaron con 20 μL de PBS y 2,5 μL de aceite mineral para cultivo celular para evitar la evaporación. Las muestras se almacenaron a 4 °C.

Se obtuvieron imágenes de células RPE primarias de ratón mediante microscopía confocal (LSM 700, microscopía ZEISS) equipada con láseres de 405, 488, 555 nm y un objetivo de aceite ×40 (EC Plan-Neofluar ×40/1,30 Oil DIC). Para la adquisición se utilizaron filtros DAPI (azul), FITC (verde) y Texas Red (rojo).

Los chips VersaLive se recubrieron con vitronectina recombinante humana truncada (5 μg/mL en PBS 1x) usando el chip en modo de entrada múltiple durante 30 min a temperatura ambiente antes de cargar las células. Después de cargar las células en el chip, las células se dejaron adherir durante la noche en una incubadora (37 °C, 5 % de CO2). En el momento del experimento, las células HK2 se perfundieron en modo multientrada a 37 °C durante 30 min con medio sin suero con 50 μg/mL de transferrina conjugada con Alexa Fluor 488 (T13342, Thermo Fisher Scientific) para permitir la endocitosis y carga de endosomas de reciclaje. Luego se cambió el medio y se agregó un medio sin suero con 50 μg/mL de transferrina sin marcar para permitir el reciclaje de la transferrina conjugada con Alexa Fluor 488 que se evaluó mediante imágenes en vivo usando un microscopio Nikon Ti equipado con un módulo de disco giratorio y un ×100 1.5 NA objetivo de aceite.

Para la transfección en el chip, las células HeLa se cargaron un día antes de la transfección siguiendo el procedimiento ya descrito. La mezcla de transfección (reactivo de transfección Lipofectamine™ 3000, ThermoFisher Scientific) se preparó de acuerdo con las pautas del fabricante y se optimizó para los volúmenes de VersaLive. La mezcla contenía 300 ng de ADN, 0,5 μL de reactivo Lipofectamine, 0,6 μL de reactivo P3000 y 10 μL de medio Opti-MEM. Luego, esta mezcla se diluyó en medio de crecimiento completo hasta un volumen final de 50 μL. Las células se perfundieron a través del modo de entrada múltiple en una incubadora de células durante 2 h agregando 5 μL de mezcla de transfección diluida en cada puerto de la cámara y aceite mineral para evitar su evaporación. Después de la transfección, la mezcla se reemplazó por medio de crecimiento completo y el chip se dejó en modo estático de entrada única en una incubadora de células durante 24 h. Luego, las imágenes fueron adquiridas utilizando el microscopio Nikon Ti Eclipse.

Las células Hela se transfectaron inversamente con pCMV-NLS-mcherry-ccp3 obtenido de la clonación Golden Gate (kit de herramientas EMMA) y un vector vacío usando Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, se recogieron las células para medir la fluorescencia mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

El efecto de la evaporación en los depósitos de entrada se evaluó ejecutando dos dispositivos microfluídicos diferentes en modo de entrada múltiple. Los depósitos de entrada n.° 1, n.° 2, n.° 4 y n.° 5 se llenaron con 25 µL de agua DI; el depósito de entrada n.º 3 se llenó con 25 µl de rodamina B (0,1 mg/ml). Para uno de los dos dispositivos, se añadieron 2,5 µL de aceite mineral para cultivo celular a los depósitos de entrada para evitar su evaporación. La intensidad de la rodamina B se midió dentro de la cámara de cultivo durante 15 ha intervalos de 15 min. Las mediciones se realizaron en las mismas condiciones experimentales utilizadas para los experimentos de microscopía de células vivas. Los datos se procesaron utilizando el software ImageJ.

Para facilitar la extracción del PDMS, se insertó suavemente una hoja de afeitar de un solo filo en la interfaz entre el PDMS y el portaobjetos de vidrio a lo largo del perímetro del chip (Figura complementaria 1a). Sucesivamente, se pellizcó el chip PDMS para despegarlo del portaobjetos de vidrio que sellaba los canales (Fig. 1b complementaria). Para la fijación química fuera del chip, primero se retiró el chip PDMS del portaobjetos de vidrio. Luego, el portaobjetos de vidrio con las células expuestas se enjuagó con PBS y luego se sumergió en la solución de PFA al 4% en peso durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, el portaobjetos se enjuagó con PBS y se secó suavemente.

El poli(A)-ARN se capturó utilizando micropartículas de poli(T)-resina, como describieron previamente los autores en las refs. 11,28. El tampón de lisis, con la composición descrita en la literatura28, se diluyó 1:1 en PBS 1x antes de iniciar los experimentos. Antes de cada proceso de extracción, se preparó una suspensión madre de perlas en tampón de lisis (3000 perlas/μl).

La secuencia para recuperar el contenido del chip comienza con el chip en modo de entrada múltiple (10 μL por depósito, figura complementaria 2a). A continuación, el puerto A se llena con tampón de lisis (7,5 μL). En esta configuración, el tampón de lisis puede fluir a través del canal principal pero no entrar en las cámaras. Sin embargo, para iniciar la lisis de una cámara, es suficiente vaciar el depósito de la cámara correspondiente (Fig. 2b-f complementaria). Para recolectar el poli(A)-ARN y preservarlo de la degradación, se colocó una alícuota de perlas (3 μL) en cada puerto (n.º 1 a n.º 5). Esta cantidad fue suficiente para cubrir la superficie inferior del puerto sin crear contrapresión. Después de 10 min, no se veían todavía células en las cámaras y se consideró que el proceso de lisis había finalizado.

Las micropartículas de resina se recuperaron de cada depósito de cámara (#1 a #5) y se colocaron en tubos de 200 μL. A continuación, las micropartículas se lavaron dos veces con 100 μL de SSC 6X y una vez con 100 μL de tampón RT. Todos los pasos de centrifugación se realizaron a 1000 × g durante 1 min. La transcripción inversa, la exonucleasa, la PCR y los pasos de purificación de la biblioteca de cDNA se realizaron como se informa en la literatura28. El ADNc amplificado se purificó con el protocolo de perlas Ampure XP. Se añadió a cada muestra un volumen de 0,6x (volumen de muestra/volumen de perlas Ampure XP) de perlas Ampure XP. Finalmente, el ADNc se eluyó en 10 μL de agua libre de ARNasa. El análisis cuantitativo y cualitativo de cada muestra se realizó utilizando un chip de alta sensibilidad TapeStation D5000.

El análisis de imágenes y el procesamiento de datos se realizaron con ImageJ y Microsoft Excel y las barras de error representan la mediana ± SD a menos que se indique lo contrario. Las réplicas son biológicas y representan experimentos en la misma línea celular pero realizados en días diferentes. Los experimentos se repitieron al menos tres veces. El tamaño de la muestra varió según la metodología y se define en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

El diseño imprimible del adaptador de incubadora de platina OkoLab H101 para el microscopio óptico Nikon Ti se proporciona como "Datos complementarios 1.dxf". Todos los datos sin procesar y procesados generados y analizados durante el estudio actual (p. ej., imágenes, tablas, máscaras de segmentación) se proporcionan como "Datos complementarios 2.zip". La tubulación del endosoma cargada con transferrina en las células HK2 se proporciona como "Película complementaria 1.avi". El efecto de la alta tensión de cizallamiento en las células HeLa en el chip se proporciona como "Película complementaria 2.avi".

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04059-4

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por la Fondazione Telethon, la Universidad de Nápoles "Federico II" y Compagnia di San Paolo (STAR Plus 2020 Linea 1) a DdB, el proyecto COSY-BIO a DdB (EU H2020 grant 766840). GN recibió el apoyo de "OPL-APPS - IIoT OPEN Platform e Applicazioni per il manufacturing" (subvención PON ARS01_00615) y SC y SB de BrightFocus Foundation (subvención M2020184). Nos gustaría agradecer a Giuliano De Carluccio y Alessio Mallozzi por su ayuda con la transfección del plásmido y por sugerir el uso de aceite mineral y experimentos con células CHO-K1, respectivamente.

Instituto Teletón de Genética y Medicina (TIGEM), Via Campi Flegrei 34, 80078, Pozzuoli, NA, Italia

Giovanni Marco Nocera, Gaetano Viscido, Stefania Criscuolo, Simona Brillante, Fabrizia Carbone, Leopoldo Staiano, Sabrina Carrella & Diego di Bernardo

Departamento de Ingeniería Eléctrica y Tecnología de la Información, Universidad de Nápoles Federico II, Nápoles, Italia

Juan Marcos Nocera

CEINGE Biotecnología Avanzada, Nápoles, Italia

Juan Marcos Nocera

Departamento de Ingeniería Química, de Materiales y de Producción Industrial, Universidad de Nápoles Federico II, Nápoles, Italia

Gaetano Viscido y Diego di Bernardo

Instituto de Investigación Genética y Biomédica, Consejo Nacional de Investigación (CNR), Milán, Italia

Leopoldo Staiano

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

GMN diseñó el dispositivo y realizó y supervisó los experimentos. GV, SB y S. Carrella realizaron experimentos de inmunotinción. FC y LS realizaron ensayos de reciclaje de transferrina. S. Criscuolo realizó experimentos de transfección de plásmidos. DdB concibió la idea y supervisó el trabajo. GMN y DdB escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Diego di Bernardo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Bowei Li, Carla Mulas y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: Eve Rogers.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Nocera, GM, Viscido, G., Criscuolo, S. et al. La plataforma VersaLive permite el cultivo microfluídico de células de mamíferos para aplicaciones versátiles. Commun Biol 5, 1034 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03976-8

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Recibido: 30 Septiembre 2021

Aceptado: 12 de septiembre de 2022

Publicado: 29 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03976-8

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