Análisis estructural y funcional del sistema linfático del tritón

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 6902 (2023) Citar este artículo

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Los vertebrados competentes para la regeneración, como los tritones y las salamandras, poseen un sistema inmunológico adaptativo debilitado caracterizado por múltiples conexiones entre el sistema linfático y el sistema vascular sanguíneo llamados corazones linfáticos. Se desconoce el papel de la vasculatura linfática y estas conexiones linfaticovenosas en la regeneración. Utilizamos linfangiografía de infrarrojo cercano in vivo, ultrasonografía de ultra alta frecuencia, linfangiografía micro-CT y reconstrucción computarizada tridimensional de sección histológica en serie para evaluar los territorios linfáticos de Cynops pyrrhogaster. Usamos nuestro modelo y supermicrocirugía para demostrar que los corazones linfáticos no son esenciales para la circulación linfática y la regeneración de las extremidades. En cambio, los tritones poseen una nueva red intraósea de vasos linfáticos dentro del hueso que expresan VEGFR-3, LYVE-1 y CD-31. Sin embargo, no pudimos mostrar la expresión de Prox-1 en estos vasos. Demostramos que la médula ósea del tritón adulto funciona como un órgano de drenaje linfático y un reservorio de grasa. Este estudio revela las diferencias anatómicas fundamentales entre el sistema inmunitario de los urodelos y los mamíferos y proporciona un modelo para investigar los sistemas linfáticos y la regeneración.

El sistema linfático consta de una red de vasos linfáticos, tejido linfoide y órganos linfoides que forman una parte importante del sistema inmunitario de los vertebrados. Los linfáticos comienzan como vasos con extremos ciegos en el tejido y forman una extensa red en todo el cuerpo, pero aún no se han identificado en la epidermis, el cartílago ni en el hueso sano. Todos los vasos linfáticos finalmente drenan hacia la circulación sanguínea a través de conexiones directas de los vasos linfáticos a las venas (linfaticovenosas).

El sistema linfático funciona en la regulación del entorno circundante de las células dentro de los tejidos mediante el control de la disponibilidad de líquidos, macromoléculas y glóbulos blancos, formando un puente importante entre las células, la matriz extracelular y el sistema vascular sanguíneo. Además de su papel tradicionalmente reconocido en el transporte de fluidos extracelulares, estudios recientes han demostrado que los vasos linfáticos también juegan un papel esencial en la cicatrización de heridas, la inmunidad, el metabolismo de las grasas, la metástasis del cáncer y las enfermedades cardiovasculares y metabólicas1,2,3,4,5,6. La falla en la regeneración de la vasculatura linfática después de una lesión da como resultado linfedema, una enfermedad desfigurante caracterizada por hinchazón progresiva de las extremidades, depósito de grasa e infecciones repetidas de celulitis que afecta a más de 200 millones de personas en todo el mundo y no tiene cura conocida7.

A pesar de la creciente literatura sobre la importancia de los vasos linfáticos en la cicatrización de heridas y enfermedades, el papel del sistema linfático en la regeneración sigue estando poco estudiado. Una de las principales razones de esto es la falta de conocimiento del sistema linfático en los anfibios urodelos (tritones y salamandras), ampliamente considerados los mejores modelos para la regeneración de vertebrados debido a su inigualable capacidad regenerativa8. Gran parte del conocimiento actual sobre los urodelos linfáticos se basa en estudios realizados hace más de un siglo y en suposiciones hechas a partir de la investigación de anuros (ranas y sapos)9,10,11.

El sistema linfático del urodelo se caracteriza por la presencia de 8 a 23 pares de corazones linfáticos (LH) ubicados en las conexiones linfáticovenosas a lo largo del cuerpo que funcionan para bombear la linfa hacia las venas y evitar el reflujo de sangre hacia los linfáticos8,10,12. Los LH no son exclusivos de los tritones. Los anuros tienen de 2 a 5 pares, mientras que los reptiles y las aves poseen un par que desaparece en la mayoría de las aves en el período postembrionario temprano10. Los mamíferos, por otro lado, no poseen LH, sino que el plexo veno-linfático inicial que se forma durante el desarrollo del saco linfático yugular ha sido descrito como el homólogo vestigial de la LH13,14. Por lo tanto, los mamíferos posembrionarios tienen solo 1 par de conexiones linfaticovenosas comunes a todos los tetrápodos ubicados alrededor de la unión de los conductos torácicos y las venas subclavias. Estas diferencias anatómicas significativas en la circulación linfática de los vertebrados tienen implicaciones correspondientemente significativas en la función del sistema linfático.

La disminución de las conexiones linfáticovenosas se correlaciona notablemente con la disminución de la capacidad de regeneración en los vertebrados (Fig. i complementaria). La evidencia de esta relación es vívidamente conspicua en el ciclo de vida de los anuros. Como renacuajos de larvas, comparten una estructura linfática idéntica a la de los urodelos con 8 o más pares de LH, lo que da un total de al menos 18 conexiones linfaticovenosas (incluidas las conexiones del conducto torácico a la vena subclavia). Durante esta fase de la vida, los renacuajos, al igual que los urodelos, poseen la capacidad de regenerar colas, extremidades y el cristalino del ojo15,16,17. Luego experimentan un declive ontogénico, pasando a un estado de incompetencia de regeneración como adultos con una disminución correspondiente en el número de LH a 2 a 5 pares15,16,17. Los estudios en la rana con garras sudafricana Xenopus laevis han demostrado que los renacuajos hasta la etapa 51 a 52 pueden regenerar una pata trasera completa con los 5 dedos después de la amputación17,18. Esta disminuye progresivamente a 3,7 dígitos en promedio en la etapa 53 y 2,5 en la etapa 55, acompañada de una pérdida progresiva de la expresión de sonic hedgehog en el tejido en regeneración17,18,19. Después de la metamorfosis, la regeneración de las patas traseras se limita a la formación de una espiga cartilaginosa que carece de dedos o músculos18,20. La etiología de esta disminución progresiva de la capacidad regenerativa en los anuros y en los vertebrados superiores, como los mamíferos, sigue sin conocerse, y la principal hipótesis atribuye esta disminución a las diferencias en la respuesta del sistema inmunitario a las lesiones20,21,22,23,24. Además, aún se desconoce si la presencia de estas múltiples conexiones linfaticovenosas facilita la regeneración.

En este estudio definimos la anatomía linfática funcional del tritón vientre de fuego japonés Cynops pyrrhogaster. Usamos nuestro modelo para demostrar que, a diferencia de los anuros, las conexiones linfaticovenosas de LH no son esenciales para la circulación linfática y no son esenciales para la regeneración. En cambio, los tritones poseen una nueva red intraósea de vasos linfáticos que expresan el receptor 3 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-3), el receptor 1 de hialuronano endotelial de los vasos linfáticos (LYVE-1) y CD-31 que conecta las redes linfáticas superficiales y profundas y mantiene la circulación linfática incluso después de la escisión de todas las LH. Este es el primer informe de linfáticos en huesos sanos y proporciona información sobre las diferencias anatómicas fundamentales en el sistema inmunológico de los urodelos y mamíferos altamente regenerativos. Este estudio también proporciona un modelo para investigar el papel de la vasculatura linfática en la regeneración y la regeneración de los vasos linfáticos en los urodelos.

En particular, existe una variación considerable en la nomenclatura anatómica utilizada en los urodelos. Esto se debe en gran parte a la escasez de literatura sobre la anatomía vascular de los urodelos y los hallazgos históricamente contradictorios de los primeros investigadores que han persistido. La monografía histórica de Francis publicada en 1934, The Anatomy of the Salamander, incluye la descripción anatómica más detallada de la vasculatura de la salamandra adulta hasta la fecha9. Por tanto, la nomenclatura utilizada en este estudio está en consonancia con esta monografía9.

Primero evaluamos los territorios de drenaje linfático in-vivo usando linfangiografía de fluoroscopia de infrarrojo cercano (NIRF) con verde de indocianina (ICG) complementada con ultrasonografía de ultra alta frecuencia (UHFUS) y linfangiografía de contraste con microtomografía computarizada (micro-CT). NIRF tiene alta resolución pero poca profundidad de penetración en el tejido, mientras que UHFUS (40–70 MHz) es útil para medir el tamaño y las pulsaciones, pero tiene una resolución relativamente mala y poca profundidad de penetración. Micro-CT, por otro lado, permite la visualización de redes linfáticas profundas para complementar NIRF y UHFUS. Los vasos linfáticos colectores se definieron funcionalmente como los vasos linfáticos más grandes que recolectan flujo distante.

Identificamos 16 pares de LH laterales ubicados en la parte posterior del tritón desde las escápulas hasta la base de la cola y numeramos estos LH1 a LH16 respectivamente. ICG fluyó rápidamente a los LH de 2 a 5 minutos después de la inyección y alcanzó su punto máximo en 10 a 15 minutos. Las extremidades y la cola fueron drenadas constantemente por vasos linfáticos colectores bien definidos en LH específicos (Fig. 1a). En la extremidad anterior, los vasos linfáticos discurren por la cara dorsal de la extremidad en dirección posterior a una red axilar y luego drenan principalmente a LH2 y LH3, luego a LH1, LH4 y LH5 a través de las conexiones del tronco linfático logitudinalis lateralis (TLyLL). Los colectores linfáticos en la superficie ventral conectaban la red de la axila con los colectores de la cabeza y la extremidad anterior contralateral (Fig. 1b). De manera similar, en la extremidad posterior, 2 vasos linfáticos colectores principales en el dorso corren posteriormente hacia la pelvis inferior y luego drenan hacia LH11 y LH12 y luego hacia LH8, LH9, LH10, LH13, LH14, LH15 y ocasionalmente LH16 a través de conexiones TLyLL (Fig. 1c) . Los vasos colectores también corren anteriormente, cruzando ventralmente la línea media y conectándose a una red alrededor de la cloaca y a los colectores de la pata trasera contralateral. La cola fue drenada por 2 colectores que corren a lo largo de la cresta lateral en los lados izquierdo y derecho que continuaron anteriormente para formar el TLyLL y drenaron en LH16 y luego en LH15 (Fig. 1d, e).

Territorios linfáticos mapeados mediante linfangiografía fluoroscópica infrarroja cercana al verde de indocianina in vivo. ( a ) Diagrama que muestra los territorios de flujo linfático de la extremidad anterior (azul), la extremidad posterior (amarillo) y la cola (verde) del tritón mapeados utilizando verde de indocianina (ICG) cerca de fluoroscopia infrarroja (NIRF). Los trunci linfáticos longitudinales laterales (TLyLL) (puntas de flecha blancas) recorren el cuerpo interconectando todos los corazones linfáticos (LH) (círculos verdes). (b) Los linfáticos de las extremidades anteriores (puntas de flecha azules) discurren anteriormente hacia una red axilar densa y drenan principalmente en LH2 y 3 (círculos verdes) y luego en LH1, 3 y 5. Los linfáticos que se recolectan de la axila cruzaron la línea media en la superficie ventral para unirse los colectores de la región de la cabeza y la extremidad anterior contralateral. Los sitios de inyección de ICG se muestran con puntas de flecha rojas. (c) Los vasos linfáticos de las extremidades posteriores (puntas de flecha amarillas) corren posteriormente y fluían principalmente a LH11 y LH12 (círculos verdes) y luego a LH8, 9, 10, 13, 14 y 15. Los vasos linfáticos de las extremidades posteriores se conectaban a una densa red alrededor de la cloaca. Los vasos linfáticos en el lado derecho (d) y el lado izquierdo (e) de la cola (puntas de flecha verdes) fueron drenados por vasos linfáticos ipsilaterales respectivos con los colectores principales a la izquierda y derecha siguiendo un curso ligeramente diferente anteriormente y procedieron a formar el TLyLL en cada lado. El líquido linfático de la cola drenaba a LH16 (círculo verde) y luego a LH15 a través de TLyLL. (f) Diagrama que muestra los territorios de flujo linfático de la pata delantera de la rana (azul) y la pata trasera (magenta) mapeados usando ICG NIRF. Los grandes sacos linfáticos subcutáneos (amarillos) que conectan los linfáticos de las extremidades y la LH (círculos verdes). ( g ) La pata trasera de la rana fue drenada principalmente por colectores dorsales (puntas de flecha magenta) a los LH posteriores (círculos verdes) y algo de líquido fluyó a los grandes sacos linfáticos subcutáneos (contorno amarillo). Los vasos linfáticos de las extremidades anteriores fluían rápidamente hacia los sacos linfáticos oscureciendo la vasculatura linfática más profunda antes de fluir hacia las LH posteriores (puntas de flecha azules). Los sitios de inyección de ICG se muestran con puntas de flecha rojas. No se observaron sacos linfáticos subcutáneos en los tritones.

En Xenopus, el drenaje de las patas traseras se realizó principalmente a través de colectores dorsales hacia los LH y sacos posteriores (Fig. 1f, g). En la extremidad anterior, el ICG se acumuló rápidamente en grandes sacos linfáticos subcutáneos que oscurecían la vasculatura más pequeña. El líquido de los sacos linfáticos luego fluyó hacia las LH posteriores. No encontramos tales sacos linfáticos en los tritones. En cambio, el exceso de tinte se acumuló en los espacios extravasculares, especialmente alrededor de la pelvis y el tejido subcutáneo de la axila y a lo largo de las vainas nerviosas que no estaban revestidas por endotelio, confirmado por la ausencia de marcadores endoteliales VEGFR-3, LYVE-1 y CD-31 (Figuras complementarias ii y iii). No se observó acumulación de líquido en estos espacios cuando se inyectaron pequeñas cantidades de medio de contraste, lo que sugiere que el flujo linfático en estas vías extravasculares tiene un papel limitado en la circulación fisiológica. No se observaron muertes ni cambios en el movimiento o en el comportamiento de alimentación después de la administración de ICG en animales seguidos hasta por 4 años.

La tasa de LH en reposo varió de 60 a 122 latidos por minuto (lpm) intercalados con períodos de asistolia y aumentó a 72-156 lpm después de la inyección de 50 μL de colorante. Cada LH latía de forma independiente con un ritmo irregular y no había sincronía entre los LH ipsilaterales o contralaterales adyacentes. Las tasas de pulsación fueron generalmente similares en todos los LH. La inyección de tinte en una región provocó un aumento simultáneo en la tasa de todos los LH, incluidos aquellos que no compartían el mismo territorio de drenaje sin recolección de tinte (datos no mostrados), lo que sugiere un control del sistema nervioso autónomo centralizado.

Se utilizó un modelo matemático elipsoide (Fig. 2a) para estimar la fracción de eyección (EF) en UHFUS y para calcular el gasto cardíaco LH (LHO) (Fig. 2b,c). La FE media fue del 60,40 %, EDV de 0,026 mm3, frecuencia de LH de 117,04 lpm, LHO de 1,838 mm3/min por LH y el total combinado de los 16 pares fue de 58,816 mm3/min. Por lo tanto, los tritones son notablemente capaces de bombear un volumen de líquido linfático equivalente a su masa corporal de 5 a 6 g cada 1 a 2 h a la circulación venosa periférica a una velocidad de 10 ml.Kg−1.min−1.

Cálculo basado en ultrasonido de ultra alta frecuencia del gasto cardíaco del corazón linfático de tritón. (a) La estructura del corazón linfático (LH) consta de una sola cámara muscular que recibe líquido linfático de los colectores linfáticos y lo bombea hacia la vena vena lateral. El LH tiene una válvula de entrada y una válvula de salida que evitan el reflujo de sangre. La reconstrucción del volumen 3D por computadora mostró que la forma del corazón linfático del tritón se ajustaba mejor a una forma similar a un elipsoide con un extremo de salida ligeramente puntiagudo y un extremo de entrada aplanado, por lo tanto, la fracción de eyección (EF) se calculó utilizando un modelo matemático elipsoide basado en 2D ultra alta. medición ultrasónica de frecuencia del volumen diastólico final de LH (EDV) (b) y el volumen sistólico final (c), y la tasa de LH. La FE media fue del 60,40% (DE 12,94), EDV 0,026 mm3 (DE 0,008) y la frecuencia cardíaca linfática media fue de 117,04 lpm (DE 23,12), lo que da un gasto cardíaco LH (LHO) de 1,838 mm3/min para cada LH y un total combinado de 58,816 mm3/min para los 16 pares.

Para evaluar las redes linfáticas profundas, realizamos una linfangiografía por micro-CT que mostró un flujo de líquido linfático a través de la línea media hacia el lado contralateral del cuerpo a través de las costillas, las vértebras y los linfáticos vertebrales profundos (Fig. 3a). Procedimos a evaluar la microcirculación de los tritones para confirmar la ubicación de estas vías linfáticas alternativas mediante cortes en serie con reconstrucción de volumen tridimensional (3D) por computadora respaldada con inmunohistoquímica y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para garantizar la eliminación de los glóbulos rojos, evitar el colapso de los lúmenes de los vasos linfáticos y mejorar la fijación, preparamos el tejido para la reconstrucción del volumen vascular 3D mediante la fijación con perfusión a través del sistema linfático. La fijación por perfusión translinfática utilizó la circulación linfática rápida, múltiples conexiones linfaticovenosas anatómicas y la escasez de válvulas venosas que permiten el flujo bidireccional a los lechos capilares para fijar adecuadamente el tritón y evitar el colapso de los vasos linfáticos. Los urodeles tienen 4 pares de grandes vasos linfáticos colectores que corren longitudinalmente a lo largo del tronco, el TLyLL que corre a lo largo de los LH y los irriga directamente, trunci linfatici longitudinales parabdominales (TLyLPab) y trunci linfatici longitudinales parepigastrici (TLyLPe) que corren por los lados lateral y ventral. las capas subcutáneas de la pared del tronco, respectivamente, y los trunci linfáticos longitudinales subvertebrales (TLyLSv), que son los más grandes de los cuatro y discurren profundamente en el tronco inmediatamente ventrales a la columna vertebral9.

Microcirculación de tritones y la red linfática de la médula ósea intraósea. (a) La linfangiografía Micro-CT mostró el movimiento del contraste inyectado en la pata trasera izquierda (punta de flecha roja) que fluyó a través de los colectores (puntas de flecha amarillas) hasta los corazones linfáticos (LH) (punta de flecha verde) y en el hueso vertebral hasta los colectores contralaterales (punta de flecha azul). ), LH contralaterales (puntas de flecha magenta) y el trunci linfático longitudinal lateralis (TLyLL) (puntas de flecha blancas). (b) La unidad linfática funcional repetida en todo el tronco del tritón. La entrada de LH desde la red linfática superficial a través de TLyLL y los linfáticos intraóseos vertebrales transversos (TvIL) que conectan la red linfática profunda con la red linfática superficial y las LH en ambos lados del cuerpo. ( c ) y ( d ) Reconstrucción de volumen 3D por computadora de sección en serie que muestra los vasos linfáticos (verde) y los vasos sanguíneos (rojo). Las TvIL (puntas de flecha amarillas) se muestran fluyendo desde el hueso hasta las LH. Los LH anteriores del tronco (c) estaban más unidos a la costilla adyacente, mientras que en la cola (d) estaban separados de los huesos por el músculo esquelético. (e) y (f) Inmunohistoquímica que muestra vasos linfáticos intraóseos y vasos sanguíneos en la médula ósea del proceso transversal de una costilla abdominal (barras de escala = 100 μm) (e) y la vértebra de la cola (barras de escala = 200 μm) (f ). Las células endoteliales linfáticas se identificaron por captación alta de rodamina-dextrano y tinción de VEGFR-3+, LYVE-1+, CD-31+ mientras que las células endoteliales de los vasos sanguíneos fueron CD-31+, LYVE-1±, VEGFR-3- y rodamina baja. -absorción de dextrano.

La red linfática se organizó funcionalmente en una red dérmica superficial y subdérmica, y una red visceral profunda con unos pocos vasos pequeños que atraviesan la capa muscular principalmente en los tabiques intermusculares que conectan los dos (Figs. iv y v complementarias). La red superficial incluía un fino plexo linfático dérmico estrechamente asociado con las glándulas mucosas y venenosas de la piel y un plexo subdérmico que contenía los colectores segmentarios TLyLL, TLyLPab, TLyLPe y el cuerpo. La red linfática profunda incluía el TLyLSv, el plexo vertebral de los vasos linfáticos y los vasos profundos que discurren junto a los principales vasos sanguíneos y nervios en los espacios intermusculares para unirse a los vasos linfáticos viscerales intraabdominales e intratorácicos profundos que finalmente drenan en las venas principales hacia la sangre del corazón. No se observaron linfáticos en la epidermis. De manera similar, no se observaron vasos sanguíneos en la epidermis. En cambio, los vasos sanguíneos formaron un plexo subepidérmico extremadamente rico y denso. El músculo también poseía una extensa red de vasos sanguíneos que conectaba los vasos sanguíneos superficiales y profundos. El lateral venoso (VL) que recibe la salida de LH corre en la capa subdérmica junto al TLyLL.

Descubrimos que la LH tenía 2 entradas principales, la TLyLL que recolectaba los vasos linfáticos superficiales y una nueva red linfática intraósea en el hueso que se conectaba a los vasos linfáticos profundos de la TLyLSv (Fig. 3b). La red linfática intraósea constaba de un vaso linfático colector principal que denominamos vaso linfático intraóseo vertebral transverso (TvIL) dentro de los procesos transversales vertebrales y las costillas, acompañado por 1 a 2 venas que conectan la salida de VL LH con el plexo venoso subvertebral, que denominamos estas son las venas intraóseas vertebrales transversas (TvIV) (Fig. 3c,d, Videos 1 y 2). Tanto el TvIL como el TvIV tenían pequeñas ramas y afluentes que formaban una red dentro de la médula ósea que conectaba con el periostio y el músculo circundante. Las venas tenían notablemente más afluentes y se caracterizaban por la presencia de múltiples válvulas que dirigían el flujo de sangre medialmente al plexo venoso subvertebral. Aparte de las 2 válvulas en los extremos de entrada y salida de las LH, no se observaron otras válvulas en la vasculatura linfática, lo que permitió un fácil flujo de fluido bidireccional y una respuesta rápida a los cambios en la circulación linfática.

La presencia de una red linfática intraósea funcional se confirmó mediante la captación de tinte de rodamina-dextrano en los vasos VEGFR-3+, LYVE-1+, CD-31+ (Fig. 3e,f). El análisis TEM (Fig. 4a-d) también confirmó la ultraestructura de los vasos linfáticos dentro de la médula ósea y los contrastó con los vasos sanguíneos25.

Ultraestructura de los vasos linfáticos y venosos intraóseos y del corazón linfático. (a) Sección de escaneo teñida con azul de toluidina incrustada en resina de una costilla abdominal de tritón que muestra los linfáticos intraóseos vertebrales transversos (TvIL) (b) y las venas intraóseas vertebrales transversales (TvIV) (c) dentro de la médula ósea y el corazón linfático adyacente ( LH) (d). La microscopía electrónica de transmisión confirmó que TvIL ((b) Barra de escala = 2 μm) y LH ((d) Barra de escala = 20 μm) estaban revestidas por células endoteliales linfáticas (LEC) con las características ultraestructurales características del endotelio linfático, incluida la ausencia de pericitos, paredes delgadas y citoplasma LEC altamente atenuado (puntas de flecha verdes (b)), con escasas uniones estrechas, pocas uniones adherentes, espacios ocasionales entre LEC (puntas de flecha amarillas (b y d')) y uniones de células endoteliales similares a hojas superpuestas (puntas azules punta de flecha (d')). El músculo LH especializado tenía rasgos característicos tanto del músculo cardíaco como del esquelético (punta de flecha blanca (d')). Por el contrario, los TvIV ((c) Barra de escala = 5 μm) estaban revestidos por células endoteliales sanguíneas (BEC) que tenían paredes más gruesas, rodeadas de pericitos (puntas de flecha magenta (c)) con varias uniones estrechas y uniones adherentes (puntas de flecha rojas (c) )) y tenía múltiples vesículas de citoplasma. También se observaron glóbulos rojos en los vasos sanguíneos.

Esta estructura que consta de los colectores linfáticos superficiales, que llevan la linfa desde los segmentos corporales periféricos a las LH a través de la TLyLL, la TvIL que transporta la linfa entre los linfáticos profundos y las LH, y la LH que bombea la linfa hacia la VL, formó la unidad linfática funcional básica que fue repetido a lo largo de todo el tronco del tritón (Fig. 3b). En los vasos linfáticos anteriores que drenan la extremidad superior, el tórax y el abdomen, el TvIL discurre dentro de las costillas y fue el vaso de entrada predominante y más grande de la LH, mientras que en la cola predominaron los colectores superficiales que drenaban las extremidades posteriores y la cola. Los LH anteriores (Video 1) también estaban más unidos a la parte dorsal posterior de la costilla adyacente, mientras que en la región de la cola (Video 2) estaban ubicados un poco más lejos de los huesos separados por algún músculo esquelético. El análisis de secciones en serie de todos los huesos de la extremidad anterior y posterior, las costillas y las vértebras del cuello, el tronco y la parte proximal de la cola, la cintura escapular y la cintura pélvica mostró que la médula ósea del tritón estaba muy vascularizada, hipocelular y extensamente llena de tejido adiposo (Suplementario Figs. vi y vii).

Las LH son esenciales para la circulación linfática en los anuros13,26,27. La interrupción experimental de su función por anestesia o ablación da como resultado hemoconcentración, edema y muerte inevitable en ranas y sapos en 2 a 4 días13,26,27. Para evaluar la función diferencial de LH en tritones y Xenopus, realizamos escisiones de LH supermicroquirúrgicas incrementales. De acuerdo con informes anteriores13,26,27, la escisión de los 2 pares de LH posteriores en Xenopus resultó en edema, aumento de peso posoperatorio (PO) del 18-29% y muerte dentro de las 12 h en todas las ranas a pesar de la presencia de LH anterior intacto (Fig. VIII complementaria). Curiosamente, ninguno de los tritones desarrolló edema, cambios de comportamiento o murió en el período de observación de 1 mes a 1 año después de la escisión de LH regional o los 16 pares de LH (Fig. 5a).

Cambios fisiológicos en la circulación linfática después de la escisión del corazón linfático. ( a ) La escisión de corazones linfáticos (LH) en tritones no causó edema, cambios histológicos ni muerte (barras de escala = 1 mm). No hubo diferencias significativas en los diámetros de las extremidades después de 1 semana de la operación (PO) (t(9) proximal = 0,729, p = 0,485, t(9) medio = − 0,504, p = 0,627, t(9) distal = 0,297 , p = 0,773) entre los tritones de escisión de LH y los controles con una buena fiabilidad entre evaluadores ICC = 0,893, IC del 95 % (0,825, 0,934). ( b ) La linfangiografía Micro-CT mostró una reducción del contraste linfático en la circulación sanguínea en los tritones de escisión de LH a los 90 días PO, con flujo colateral de Trunci linfatici longitudinales parabdominales (TLyLPab) visto (puntas de flecha amarillas). El análisis de la vena cava posterior (VCP) mostró que los tritones de escisión de LH tenían un valor gris medio significativamente más bajo (t (34) = − 3,156, p = 0,003) que los controles. (c) El análisis de linfangiografía de fluorescencia con rodamina-dextrano del flujo de los linfáticos a las venas (barras de escala = 100 μm) también mostró una disminución significativa en la densidad de los vasos sanguíneos que reciben líquido linfático (t(188) = 13,057, p < 0,001) a los 28 días después de la escisión de todos los LH, pero esto volvió a la normalidad a los 120 días PO (t (161) = − 0.854, p = 0.394). ( d ) La ecografía de ultra alta frecuencia mostró un aumento significativo (t (12) = - 2.707, p = 0.019) en la tasa de LH en tritones que tenían una escisión de LH posterior bilateral. ( e ) El flujo colateral mantuvo la circulación linfática después de la escisión de las LH. Se muestra la garantía de TLyLPab (puntas de flecha amarillas) con conexiones a TvIL (punta de flecha magenta). Estos resultados confirmaron que la extirpación de LH interrumpió con éxito el flujo linfático periférico a las venas durante 90 días, después de lo cual se restableció el flujo linfático normal a las venas a los 120 días PO. Los datos representan la media ± desviación estándar (barras de error).

La evaluación cuantitativa del flujo linfático a la vena se realizó mediante micro-CT cuantitativa de la vena cava posterior (VCP) (Fig. 5b) y midiendo la densidad de los vasos sanguíneos intramusculares que habían recibido tinte de rodamina-dextrano de los linfáticos (Fig. 5c). El VCP es una vena principal con un curso constante en los tritones. A diferencia de otras venas principales, descubrimos que la VCP, al igual que los vasos sanguíneos intramusculares, no estaba acompañada por múltiples vasos linfáticos grandes, lo que la hacía ideal para estudiar el flujo linfático periférico a la vena. Los tritones con escisión de LH tuvieron un flujo linfático a la vena significativamente más bajo a los 28 días PO (p < 0,001) y a los 90 días (p = 0,003) que aumentó a valores normales después de 120 días (p = 0,394), lo que confirma que la eliminación de LH terminó efectivamente con el flujo linfático venoso. conexiones y reducción del flujo linfático a las venas.

Para determinar por qué los tritones no desarrollaron ningún síntoma de disfunción linfática después de la escisión de LH, realizamos una evaluación circulatoria fisiológica después de la escisión de algunas o todas las LH. UHFUS mostró que la tasa de bombeo de las LH anteriores restantes en los tritones a los que se les extirpó la LH posterior fue significativamente mayor que en los controles (Fig. 5d). Este aumento compensatorio de la actividad de LH incrementó correspondientemente la producción de cada LH en un 20 %, pero la producción combinada general de los 9 pares restantes (41.454 mm3/min) fue aún más baja que la producción combinada en los tritones normales. La linfangiografía por micro-CT de tritones con escisión de LH mostró el agrandamiento de los vasos linfáticos colaterales en el plano subdérmico que corren longitudinalmente y transportan líquido linfático a los TvIL (Fig. 5b, e).

Para confirmar si las LH se regeneran, realizamos una disección microquirúrgica in vivo en serie, UHFUS y linfangiografía micro-CT después de la escisión completa de LH únicas y múltiples. La regeneración siguió consistentemente 5 etapas morfológicas (Fig. 6a-e). Después de la resolución del coágulo, se observó por primera vez angiogénesis robusta y restauración de la estructura de los principales vasos sanguíneos en los primeros 28 a 60 días PO (Fig. 6a-e). Esto fue seguido por linfangiogénesis 50-80 días PO (Fig. 6e,f) y regeneración completa de los LHs 100-130 días PO (Fig. 6g) con los LHs de la cola más caudales tardando un poco más en regenerarse completamente y reanudar el bombeo que los LHs. más LH del tronco craneal. Las LH regeneradas tenían tamaño, forma, estructura, ubicación y función idénticos a los de la LH original, incluidas válvulas y flujo completamente funcionales, demostrado por la captación de tinte de rodamina-dextrano (Figs. 6g y 7). Las células endoteliales linfáticas (LEC) recién regeneradas tenían una fuerte expresión de VEGFR-3, LYVE-1 y CD-31 (Fig. 7).

Etapas morfológicas de la regeneración del corazón linfático después de la escisión completa. (a) Corazón linfático normal (LH) (puntas de flecha magenta) con su nervio de suministro (puntas de flecha azules), el trunci linfático longitudinal lateralis (TLyLL) (puntas de flecha negras) y el lateral venoso (VL) (puntas de flecha rojas). La función de LH se confirmó mediante la recolección de rodamina-dextrano (barras de escala = 100 μm). (b) El defecto tisular inmediatamente después de la escisión de LH. También se resecó un segmento de TLyLL, VL y el nervio de inervación, todos los cuales están íntimamente asociados con la LH. (c) Etapa 1 Postoperatorio (PO) Días 5 a 10: A la formación de coágulos le siguió la acumulación de una masa de tejido frágil y blanda debajo de la epidermis de la herida. (d) Etapa 2 PO Días 28 a 40: angiogénesis de varios vasos sanguíneos pequeños que interconectan los extremos cortados de la VL y los otros vasos sanguíneos principales. No se observa linfangiogénesis en el sitio de la lesión. La histología mostró músculo y fibroblastos en regeneración, pero no linfáticos funcionales sin acumulación de rodamina-dextrano. (e) Etapa 3 PO Día 50–60: Maduración de los vasos sanguíneos que restauran su tamaño y estructura originales y restauración de la continuidad de VL. Se observaron pequeños vasos linfáticos brotando de los bordes de la herida hacia la zona lesionada. (f) Etapa 4 PO Días 80–100: maduración de vasos linfáticos con flujo activo y acumulación de colorante observada como una masa quística en la región de la LH original, pero sin pulsaciones. (g) Etapa 5 PO Día 100–130: Regeneración completa de LH con pulsación. Los LH regenerados tenían válvulas de entrada y salida completamente funcionales y captación de rodamina-dextrano, lo que confirma que eran completamente funcionales.

Expresión de marcador de células endoteliales linfáticas en linfáticos recién regenerados. Secciones histológicas que muestran el corazón linfático regenerado (LH) (punta de flecha amarilla) y la costilla adyacente (punta de flecha azul) en la región abdominal 120 días después de la escisión microquirúrgica completa. Las LH recién regeneradas tenían forma, tamaño, estructura, posición y función idénticas a las de la LH original. Además, la LH recién regenerada demostró una fuerte expresión de los marcadores de células endoteliales linfáticas VEGFR-3 y LYVE-1 y el marcador panendotelial CD-31. La captación de tinte de rodamina-dextrano confirmó que los vasos linfáticos eran completamente funcionales (barras de escala = 200 μm).

Se realizó un ensayo controlado aleatorizado para evaluar la función de las conexiones linfaticovenosas de LH en la regeneración de las extremidades utilizando el modelo linfático de las extremidades posteriores. Se realizó una escisión supermicroquirúrgica incremental de LH9 a LH15 en los tritones del estudio y una operación simulada en los controles seguida de la amputación de la pata trasera izquierda (Fig. 8a). Los dos grupos tenían una longitud media similar desde el hocico hasta la cola, grupo de estudio (101,55 mm, SD 4,57) y controles (101,97 mm, SD 4,82) t(60) = − 0,352, p = 0,726, y peso corporal medio similar, estudio grupo (5,37 g, SD 1,22) y los controles (5,45 g, SD 1,17) t(60) = − 0,245, p = 0,808. Todos los tritones recibieron el tratamiento experimental asignado. El seguimiento fue completo en 52 tritones con 10 tritones, 4 estudio y 6 controles, incapaces de recuperarse completamente de la anestesia y fallecieron después de la cirugía pero esta diferencia no fue significativa p = 0,732. No hubo diferencia significativa en el tiempo necesario para llegar a cada una de las etapas de regeneración entre los tritones del estudio y los controles. El número medio de días para alcanzar el punto final de la etapa de crecimiento digital fue de 47,81 días (DE 8,56) en el grupo de estudio y de 47,52 días (DE 10,137) en los controles, p = 0,773 (Fig. 8b). El análisis adicional de subgrupos no mostró diferencias estadísticamente significativas entre la escisión de LH unilateral y bilateral, y entre la amputación el mismo día que la escisión de LH y la amputación retrasada 1 semana (Fig. 8c-i).

Ensayo de control aleatorizado que evalúa el resultado de la escisión del corazón linfático sobre la tasa y la morfología de la regeneración de las extremidades. (a) El diseño de ensayo de control aleatorio: n = 62 tritones se inscribieron y se separaron en 4 bloques, cada bloque se aleatorizó en un grupo de estudio y control por un asistente independiente cegado. El seguimiento fue completo en 52 tritones, 10 tritones murieron inmediatamente después de la operación. (b) No hubo una diferencia estadísticamente significativa en la tasa general de regeneración entre los grupos de estudio y control (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,662, p = 0,773). (c-h) El análisis de subgrupos tampoco mostró diferencias estadísticamente significativas en las tasas de regeneración entre los tritones de estudio y de control después de la escisión unilateral de LH (Z de Kolmogorov-Smirnov = 0,730, p = 0,660), independientemente del momento de la amputación inmediata después de la LH escisión (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,617, p = 0,841) y amputación retrasada 1 semana después de la escisión de LH (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,661, p = 0,774). De manera similar, no se encontraron diferencias significativas entre los tritones del estudio y los de control después de la escisión incremental bilateral de LH (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,778, p = 0,579) independientemente del momento de la amputación inmediata (Kolmogorov-Smirnov Z = 1,284, p = 0,074) y amputación retrasada PO de 1 semana (Kolmogorov-Smirnov Z = 1,193, p = 0,116). (i) La comparación de los tritones del estudio de escisión de LH de los diferentes lotes experimentales (excluyendo los controles) tampoco mostró una diferencia significativa en el tiempo necesario para completar la regeneración (Kruskal-Wallis H (3) = 0.1.229, p = 0.746). ( j ) La comparación de las anomalías morfológicas en las extremidades regeneradas no mostró diferencias estadísticamente significativas (p = 0,150) entre los tritones de estudio y de control. Los datos representan la media ± desviación estándar (barras de error).

Menos tritones en el grupo de estudio desarrollaron anomalías en las extremidades regeneradas en comparación con los controles; sin embargo, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. 8j). Las anomalías de extremidades más comunes observadas fueron duplicaciones de dígitos (n = 6 tritones) y dígitos faltantes (n = 4 tritones).

La microcirugía reconstructiva linfática del linfedema ha establecido que, al igual que los angiosomas de los vasos sanguíneos, la vasculatura linfática, a pesar de sus extensas interconexiones, también está organizada en unidades funcionales con colectores linfáticos específicos que drenan preferentemente un bloque tridimensional específico de territorio tisular, también conocido como linfosoma28,29,30. Definir estos territorios es fundamental para comprender la anatomía funcional, el desarrollo embriológico, el tratamiento microquirúrgico y el modelado experimental del sistema linfático. En este estudio, evaluamos la anatomía linfática funcional del tritón y revelamos una nueva red linfática dentro de la médula ósea que conecta las redes linfáticas superficiales y profundas. Usamos nuestro modelo y supermicrocirugía de precisión para demostrar que las múltiples conexiones linfaticovenosas de LH, que son una característica distintiva importante de los sistemas linfático e inmunológico de los tritones y otros vertebrados altamente competentes para la regeneración (Fig. Suplementaria i), no son esenciales para la regeneración. Además, demostramos que los tritones son capaces de regenerar LH completamente funcional después de la escisión completa en un proceso gradual característico. Por lo tanto, los tritones proporcionan un modelo útil para investigar tanto el papel de la vasculatura linfática en la regeneración como la regeneración de los linfáticos. Sin embargo, las notables diferencias anatómicas entre urodelos, anuros y mamíferos encontradas en este estudio deben ser consideradas en la traducción de los resultados.

Históricamente, la investigación linfática se ha rezagado con respecto a la de los vasos sanguíneos porque los linfáticos son generalmente más pequeños, difíciles de visualizar sin el uso de tintes de contraste y comparten muchos marcadores moleculares con los vasos sanguíneos, lo que dificultaba su discriminación antes de la llegada de los marcadores LEC Prox-1, VEGFR-3, LYVE-1 y podoplanina. Panizza fue el primero en estudiar los linfáticos de las salamandras en 1883 utilizando mercurio como agente de contraste, pero este fue muy criticado por provocar la deformación de espacios linfáticos más grandes debido a su peso y fue reemplazado por colorantes líquidos y semigelatinosos9,10. Estos métodos no eran adecuados para su uso in vivo y revelaron poco sobre la anatomía linfática funcional. Utilizamos ICG NIRF como nuestra modalidad principal complementada con UHFUS y linfangiografía micro-CT para definir los territorios linfáticos de la extremidad anterior, la extremidad posterior y la cola del tritón in vivo y validamos nuestro modelo al mostrar una disminución del flujo linfático a la vena después de la escisión de LH. Estas regiones fueron seleccionadas para crear modelos linfáticos porque son las más utilizadas en la investigación de regeneración. Una limitación importante de NIRF que observamos tanto en tritones como en ranas es que los pigmentos oscuros de su piel absorben la luz del infrarrojo cercano. Por lo tanto, tuvimos que utilizar animales albinos transgénicos, lo que posteriormente limitó el tamaño de nuestras muestras.

Nuestros hallazgos mostraron que el sistema linfático de los urodelos es considerablemente diferente al de los anuros. Aunque el 60,40 % de FE que encontramos en los LH de los tritones fue comparable al 20 a 80 % informado en los anuros, las tasas de LH y de FE de los tritones no mostraron una gran variación con el estado de alerta del animal26,31. La producción combinada total resultante de 10 ml.Kg−1 min−1 de los 16 pares de LH en tritones también fue el doble de los 0,9–5 ml.Kg−1 min−1 estimados que fluyen a través de todos los anuros LHs26. Paradójicamente, a diferencia de los anuros, ni la anestesia general completa ni la extirpación completa de algunas o todas las LH en los tritones dieron como resultado una disfunción linfática o la muerte, con la rápida movilización del flujo colateral y la restauración de la circulación. Este reclutamiento de colaterales después de la interrupción de algunos colectores linfáticos principales es compartido por la mayoría de los demás vertebrados, excepto los anuros. A este respecto, el sistema linfático de los urodelos anatómicamente comparte más similitudes con otras clases de vertebrados que con los anuros adultos. Además, demostramos que los tritones no poseen los grandes sacos linfáticos subcutáneos característicos de los anuros adultos10,32. El resultado de la biología única en los anuros significa que su flujo linfático depende en gran medida del movimiento muscular y la ventilación pulmonar para el flujo de linfa periférica hacia los sacos linfáticos y también depende de sus LH para el drenaje de la linfa hacia la circulación sanguínea. Por lo tanto, el sistema linfático de los anuros representa una adaptación de diversión altamente especializada para satisfacer las necesidades únicas de la arquitectura corporal de los anuros en lugar del modelo anfibio exclusivo de progresión evolutiva.

Sorprendentemente, identificamos una nueva red intraósea de linfáticos en la médula ósea de tritones normales que conectan la red linfática superficial, el plexo vertebral profundo más grande y las LH. El paso preferencial de estos vasos a través de la cavidad ósea proporciona protección mecánica contra el colapso de la luz del vaso. Esta extensa red mantuvo la circulación linfática incluso después de la eliminación de todas las LH, previniendo la disfunción linfática en los tritones. En particular, no pudimos utilizar la expresión de Prox-1 para la identificación de LEC a pesar de múltiples intentos en diferentes condiciones experimentales. Por lo tanto, adoptamos un enfoque multimodal que combina la reconstrucción 3D por computadora de secciones en serie con linfangiografía Micro-CT respaldada por análisis de expresión de células endoteliales VEGRF-3 y LYVE-1, estudios de inyección de colorante TRITC-dextrano y análisis TEM para demostrar de manera integral la presencia de un vaso linfático. red en los huesos vertebrales y costillas (Figs. 3 y 4). Sin embargo, aún se requiere la tinción de Prox-1 para probar definitivamente la identidad linfática de los vasos VEGFR-3+ y LYVE-1+ en las vértebras, las costillas y los huesos largos (Fig. v complementaria).

A pesar de ser un órgano linfoide primario clave del sistema linfático en muchos vertebrados, la vasculatura linfática en el hueso solo se ha identificado en estados patológicos que incluyen tumores óseos vasculares y tumores óseos malignos primarios y secundarios extensos33,34,35. La aversión de los huesos de los mamíferos por los linfáticos se destaca de manera más dramática en la enfermedad de Gorham-Stout, un trastorno poco conocido caracterizado por la aparición de vasos linfáticos en el hueso que conducen a una reabsorción ósea progresiva y altamente destructiva que hace que el hueso afectado desaparezca por completo36. Nuestros resultados muestran que, a pesar de la presencia de linfáticos, el hueso del tritón adulto no es un órgano linfoide primario ni secundario37,38, sino que funciona como un importante órgano de drenaje linfático y un reservorio de grasa en los tritones. Especulamos que los linfáticos también pueden funcionar en el metabolismo y la movilización de este depósito de grasa en la médula ósea.

A diferencia del sistema inmunitario innato, el papel del sistema inmunitario adaptativo en la regeneración de los tritones es poco conocido. Los análisis de scRNA-seq en axolotl han identificado consistentemente marcadores de células T y B tac e igll5 en etapas críticas de la regeneración de extremidades39,40,41. Sin embargo, nuestro resultado que no muestra cambios significativos en la regeneración después de la escisión de los principales componentes de la vasculatura del sistema linfático del tritón, en consonancia con los informes anteriores sobre la escisión del órgano linfoide secundario más grande, el bazo, sugiere fuertemente que la respuesta inmunitaria adaptativa puede no ser esencial para la regeneración. pero en cambio puede tener un papel regulador42.

El linfedema es el resultado directo del deterioro de la función vascular linfática. Los mecanismos precisos detrás del fracaso de la regeneración linfática después de una lesión por cirugía y quimiorradiación aún se desconocen43. La cicatrización y la fibrosis mediadas por TGF-β1, así como la esclerosis y la pérdida de la actividad de bombeo de los vasos linfáticos colectores, se reconocen como pasos precipitantes en la fisiopatología del linfedema43,44. Aparte de la LH, los vasos linfáticos de los anfibios carecen tanto de las paredes pulsantes musculares como de las válvulas que se observan en los linfáticos colectores de los mamíferos45. Este atributo hace que los LH sean ideales para modelar los aspectos estructurales y funcionales de los linfáticos colectores humanos. En particular, a diferencia del músculo liso que se encuentra en los mamíferos colectores, la musculatura LH del tritón comparte las características del músculo esquelético y cardíaco13,46. Mostramos que los tritones son capaces de regenerar LH después de la escisión completa. La alta expresión de VEGFR-3 en las LEC recién regeneradas sugiere que, al igual que los mamíferos, la regeneración linfática en los tritones también puede depender de la vía VEGF-C/VEGFR-347. Especulamos que el daño del suministro nervioso puede ser la razón por la cual los LH más caudales retrasaron la reanudación de la actividad de bombeo. Los estudios en ranas mostraron que el bombeo de LH tarda entre 20 y 30 días en recuperarse después de la denervación46. La regeneración observada de la vasculatura sanguínea que precede a los linfáticos recuerda el desarrollo embriológico de los linfáticos que expresan Prox-1 que brotan de los vasos sanguíneos48,49. Los estudios futuros deberían centrarse en la fuente de las LEC en las LH en regeneración, la expresión espaciotemporal diferencial de Prox-1, LYVE-1, VEGFR-3, SOX18 y otros factores asociados con la linfangiogénesis, así como los factores que influyen en la recuperación completa. de la actividad de bombeo.

Clínicamente, la creación microquirúrgica de anastomosis linfaticovenosas (LVA), ya sea sola o como LVA eferente en transferencias de ganglios linfáticos vascularizados, ahora se considera ampliamente el principal tratamiento quirúrgico del linfedema y los trastornos del flujo linfático50,51,52,53. Estos funcionan de manera muy parecida a las conexiones linfaticovenosas naturales de LH de los tritones. Por lo tanto, enfocamos nuestro estudio en estas conexiones porque presentan una oportunidad fácilmente disponible para la traducción quirúrgica de posibles beneficios terapéuticos en pacientes más allá de la circulación de fluidos. La falta de asociación de las conexiones linfáticovenosas con la regeneración encontrada en este estudio ofrece información preliminar sobre la biología del tejido en curación después de la LVA. Sin embargo, la estrecha asociación de las conexiones linfaticovenosas LH de los tritones con los linfáticos óseos intraóseos, que están naturalmente ausentes en los humanos, presenta un recordatorio consecuente de las diferencias en la fisiología linfática entre los tritones y los humanos. Abordar las funciones inmunológicas y metabólicas de esta red linfática intraósea puede proporcionar información sobre la ausencia evolutiva de linfáticos en el hueso humano, su papel en la enfermedad, la inmunidad, el metabolismo de las grasas y posiblemente en la regeneración.

Los tritones de panza de fuego japoneses adultos albinos transgénicos y de tipo salvaje Cynops pyrrhogaster de 90 a 120 mm de largo desde el hocico hasta la cola se obtuvieron de la Facultad de Ciencias de la Vida y Ambientales de la Universidad de Tsukuba54. Las ranas con garras sudafricanas de tipo salvaje y albinas Xenopus Laevis se obtuvieron de una tienda de mascotas local. Los tritones de tipo salvaje y todas las ranas se alojaron en el Departamento de Cirugía Plástica de la Universidad de Mie, mientras que los tritones albinos se alojaron en la Facultad de Ciencias Ambientales y de la Vida de la Universidad de Tsukuba. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y las normas aprobadas por el Comité de cuidado de animales de la Universidad de Mie y el Comité de cuidado y uso de animales de la aprobación de la Universidad de Tsukuba (Código de registro 170110). Todos los métodos se realizaron e informaron de conformidad con las directrices ARRIVE 2.055.

Los animales recibieron anestesia con solución FA100 al 0,1 % (4-alil-2-metoxifenol; DS Pharma Animal Health, Osaka, Japón) en agua a temperatura ambiente durante 1-2 h antes de los procedimientos experimentales56.

La linfangiografía ICG NIRF se realizó en tritones albinos transgénicos54 (n = 9 tritones) y ranas albinas (n = 3 ranas). Se utilizó una inyección subcutánea con una aguja 34G de 10–20 μL de una solución 1:1000 de Diagnogreen 25 mg/ml (Daiichi Sankyo, Tokio, Japón) diluida con agua estéril para inyección para evaluar el flujo linfático en condiciones fisiológicas normales y se administraron 50 μL. Se utiliza para evaluar el exceso de drenaje de líquido tisular. Las inyecciones de las superficies dorsal y ventral de la mano (miembro anterior) y el pie (miembro posterior), y los lados izquierdo y derecho de los 10 a 15 mm distales de la cola se evaluaron por separado. El flujo linfático se visualizó y registró utilizando una cámara PDE Neo NIRF (Hamamatsu Photonics, ciudad de Hamamatsu, Japón) con gran aumento a una distancia de 15 a 25 cm de los animales.

La inmunohistoquímica se realizó según lo descrito previamente por Casco-Robles et al.57. Brevemente, las muestras se lavaron en PBS, TritonX-100 al 0,2 % en PBS y nuevamente en PBS durante 15 min cada una, se incubaron en solución de bloqueo (suero de cabra normal al 2 % (S-1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.)/0,2 % TritonX-100 en PBS) durante 2 h, se lava como antes y luego se incuba en anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo. Para la tinción de VEGFR-3 se usó tTBS en lugar de PBS. Los estudios de tinción de fluorescencia se realizaron con tetrametilrodamina-dextrano 2 000 000 MW (Invitrogen D-7139) reconstituido en agua estéril para inyección inyectada por vía subcutánea de 20 a 50 μl y muestras de tejido recolectadas 10 a 15 minutos después. Los vasos linfáticos se identificaron y diferenciaron de los vasos sanguíneos comparando la captación diferencial de rodamina-dextrano y la tinción diferencial de VEGFR-3, LYVE-1 y CD-31. Las LEC se identificaron como VEGFR-3+, LYVE-1+, CD-31+ y las BEC se identificaron como CD-31+, LYVE-1±, VEGFR-3-. Se intentó una identificación adicional de los vasos linfáticos mediante tinción con anticuerpos Prox-1 disponibles en el mercado en tritones adultos maduros en condiciones experimentales variables, pero no tuvo éxito (datos no mostrados). Las imágenes de histología se capturaron utilizando un microscopio Keyence BZ-X710 y un Olympus AX80 junto con una cámara digital de microscopio Olympus DP74. El procesamiento de imágenes se realizó utilizando Image J58,59.

Se compraron los siguientes anticuerpos, Anti-LYVE-1 Novus (NB600-1008), Anti-CD-31 Bioss (BS-0195R), Anti-LYVE-1 Abcam (Ab14917). El anticuerpo anti-VEGFR-3 se fabricó a medida basándose en el ortólogo de nucleótidos de tritón de Eurofins Japan. En los datos complementarios se proporcionan más detalles sobre los anticuerpos utilizados.

Después de la anestesia, se inyectaron subcutáneamente 50 μL de colorante ICG en las extremidades o la cola de los tritones y las ranas. Se realizó una incisión cutánea longitudinal en la espalda inmediatamente inferior a la cresta de la línea lateral que recubre las LH que se eliminarán con un bisturí quirúrgico n.º 15 y se levantó un colgajo de piel de 2-3 mm de ancho en el plano subdérmico utilizando la técnica de disección de supermicrocirugía y OMS Microscopios quirúrgicos 800 y OMS 610A (Topcon, Tokio, Japón) para preservar las perforantes de los vasos sanguíneos de la piel. Los LH se identificaron visualmente mediante pulsaciones y recogida de colorante ICG. Las LH se extirparon utilizando una técnica de supermicrocirugía e instrumentos de titanio de supermicrocirugía (EMI Factory CO., Ltd. Nagano, Japón) para preservar cuidadosamente el tejido circundante en el grupo de estudio, mientras que en los controles se realizó una cirugía idéntica pero las LH se dejaron intactas. Los colgajos de piel se cerraron con suturas discontinuas de nailon 10/0.

Un total de 62 tritones se inscribieron en el ensayo de control aleatorio y se dividieron en 4 bloques diseñados para evaluar la regeneración después de la escisión incremental de LH y la regeneración después del inicio de los cambios circulatorios en 1 semana PO. Luego, los tritones se aleatorizaron en grupos experimentales aproximadamente iguales utilizando SPSS 26 por un asistente ciego e independiente (del Departamento de Cirugía de HPB). Se utilizaron pruebas T independientes para comparar la longitud media desde el hocico hasta la cola y el peso de los dos grupos. Las 7 LH que drenan la extremidad inferior se identificaron en todos los tritones y se extirparon utilizando la técnica supermicroquirúrgica como se describe anteriormente en el grupo de estudio, mientras que en los controles se realizó una disección idéntica pero las LH se dejaron intactas. Se amputó la pata trasera izquierda 2 mm proximal a la articulación de la rodilla utilizando un bisturí quirúrgico del n.º 10 y se recortó el fémur que sobresalía al ras de la herida. Se aplicó una presión suave durante unos minutos para lograr la hemostasia. No fue posible el cegamiento de los investigadores debido a la naturaleza quirúrgica del tratamiento experimental. Sin embargo, para limitar el sesgo, el grupo asignado se reveló a los microcirujanos solo después de la exposición de la herida y la microdisección linfática. Los tritones se mantuvieron sin alimentar en recipientes de plástico separados a temperatura ambiente, se observaron diariamente y se registró la etapa morfológica de regeneración60. Nuestro protocolo original planeó la evaluación del tiempo de regeneración de la extremidad por parte de 3 investigadores ciegos. Sin embargo, nos apartamos del protocolo debido a la disponibilidad limitada de personal entre 2020 y 2021 y, en su lugar, un solo investigador no cegado realizó esta evaluación. La tasa de regeneración se comparó entre los grupos de estudio y control utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos muestras. La prueba de Kruskal-Wallis se utilizó para el análisis de subgrupos del grupo de estudio de tritones de escisión de LH. La evaluación de la morfología de las extremidades regeneradas fue realizada por 2 investigadores ciegos. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para comparar las proporciones de extremidades regeneradas anómalas morfológicas y muertes por PO.

En tritones (n = 6 tritones del grupo de estudio, n = 5 tritones de control) se midió el diámetro de la pata trasera izquierda en 3 puntos; 3 mm proximal a la articulación del tobillo, en la articulación de la rodilla y en el muslo 2 mm proximal a la rodilla 1 semana después de la escisión de la LH por 2 asistentes independientes ciegos. El coeficiente de correlación intraclase se calculó en función de una calificación media (k = 2), acuerdo absoluto, modelo de efectos mixtos de 2 vías. Para las ranas (n = 2 ranas), las ranas se secaron con una toalla de papel para eliminar el exceso de agua y se midió el peso corporal total usando una microbalanza digital.

La densidad de vasos intramusculares positivos para rodamina-dextrano se evaluó contando el número de vasos en un campo de 20 × en 24 a 36 secciones transversales de parafina diferentes de la base de la cola, el abdomen y el pecho de cada tritón. Se evaluaron N = 3 tritones 28 días después de la escisión de todas las LH, n = 1 tritón evaluado después de 120 días y n = 3 tritones de control 28 días y 120 días después de una operación simulada. Se usaron pruebas T independientes para comparar las densidades de vasos entre los grupos.

La linfangiografía Micro-CT se realizó con CosmoScan GXII (Rigaku, Tokio, Japón) antes y 10 a 60 minutos después de la inyección subcutánea de 10 a 50 μl de iohexol (Omnipaque®300, GE Healthcare Pharma, Tokio, Japón) y las imágenes se procesaron con RadiAnt Software de visor DICOM. El análisis cuantitativo del VCP se realizó utilizando la Imagen J59. El valor gris medio de la sección transversal de la VCP se midió en 6 puntos diferentes a lo largo de su curso desde la pelvis hasta el hígado en cada tritón y se usó una prueba T independiente para comparar el estudio (n = 3 tritones) y el control (n = 3 tritones) grupos.

UHFUS se realizó en 6 tritones (n = 2 tritones normales, n = 2 tritones de resección LH, n = 2 tritones de operación de control) usando VeVo MD UHF70 (FUJIFILM Visualsonics, FUJIFILM, Tokio, Japón) antes y después de la inyección de 20–50 μL solución salina en las extremidades. Se utilizó un total de n = 8 LH de 2 tritones para calcular LH EF. Se usó un total de n = 3 LH de 2 tritones de estudio y n = 11 LH de 1 control y 2 tritones normales para comparar la compensación de la tasa de LH después de la escisión de la LH posterior usando una prueba T independiente.

Para la escisión única de LH (n = 5 tritones), se elevó un colgajo de piel de 2 × 4 × 2 mm en la parte proximal de la cola y se extirpó una sola LH utilizando la técnica supermicroquirúrgica como se describió anteriormente. La regeneración se evaluó abriendo el colgajo de piel a intervalos semanales y luego mensuales durante 150 días. Para la escisión múltiple de LH, se observaron n = 1 tritón posterior a la escisión de los 16 pares de LH y n = 16 tritones del grupo de estudio del experimento de regeneración de extremidades a los 100 a 150 días abriendo colgajos de piel a lo largo del área donde se extrajeron las LH y usando linfangiografía micro-CT. La linfangiografía con tetrametilrodamina-dextrano y la IHC se realizaron en secciones histológicas seriadas a los 28 días (n = 3 tritones) y 120 días (n = 1 tritón).

FixLyP se realizó para eliminar los glóbulos rojos de los vasos sanguíneos y reparar los vasos linfáticos para evitar su colapso en preparación para la reconstrucción de volumen 3D por computadora de diapositivas en serie. Se realizó una incisión en la piel del abdomen en la línea media con cuidado de no penetrar en el peritoneo. La VCP (diámetro de 0,3 a 0,5 mm) se identificó a medida que asciende desde la pelvis hacia el hígado inmediatamente en profundidad hasta el peritoneo utilizando un microscopio quirúrgico. Se abrió el peritoneo, se aplicaron pinzas microvasculares de pequeño tamaño proximal y distalmente, y se cortó la vena 5 mm antes de que entrara en el hígado. El extremo cefálico de la vena se preparó utilizando una técnica microquirúrgica estándar para diseccionar la adventicia. A continuación, se insertó una aguja vascular roma de punta redonda microvascular en el extremo cefálico de la vena y se soltaron las pinzas vasculares. Se inyectó lentamente heparina salina fría a 4 °C en la vena con una jeringa de 1 ml, lo que permitió que el extremo caudal de la vena sangrara libremente hasta que el color del hígado se volviera blanquecino y se observara el drenaje de heparina salina transparente. A continuación, se inyectó lentamente paraformaldehído al 4 % (PFA) frío a 4 °C a 20–50 μL/peso corporal (g)/min en el tejido subcutáneo de las extremidades y la cola hasta que el cuerpo del tritón se volvió rígido. A continuación, se recogieron las muestras y se colocaron inmediatamente en PFA frío al 4 % durante 4 h y luego se desmineralizaron con EDTA durante 2 días.

Las secciones incrustadas en parafina en serie de 5 μm de espesor se tiñeron con HE y se escanearon a 20 × utilizando un escáner de diapositivas digital NanoZoomer S360 (Hamamatsu Photonics K. K, Hamamatsu, JAPÓN). La reconstrucción del volumen por computadora digital en 3D de 900 diapositivas en serie del abdomen y la cola se realizó utilizando el plugin Image J (FiJi Version 1.53f51) TrakEM258,59. En los casos en que una sección de tejido estaba muy distorsionada o dañada por artefactos de preparación, la imagen se excluía de la pila y se duplicaba la imagen adyacente que mejor se ajustaba para mantener el volumen de tejido. Los vasos linfáticos se rastrearon y marcaron de forma retrógrada, mientras que los vasos sanguíneos se marcaron anterógrados desde los LH (Fig. iv complementaria).

Las muestras se prefijaron en glutaraldehído al 2,5 % durante 2 h a 4 °C, luego se desmineralizaron con K-CX (Falma, Tokio, Japón), se lavaron 3 veces en PBS durante 10 min y se posfijaron en OsO4 al 1 % durante 1 h. El lavado con PBS se repitió dos veces durante 15 min y la muestra se deshidrató en concentraciones crecientes de etanol y luego se transfirió a acetona. Las muestras se infiltraron y luego se incluyeron en resina epoxi. Se prepararon secciones de escaneo de 400 μm en serie teñidas con azul de toluidina para microscopía óptica y se cortaron secciones de 80 nm para microscopía electrónica de transmisión y luego se observaron usando un microscopio electrónico JEM-1400Flash (JEOL, Tokio, Japón).

Los análisis se realizaron con SPSS 26 (IBM Corp. Lanzado en 2019. Armonk, NY) y SPSS 27 (IBM Corp. Lanzado en 2020. Armonk, NY). Todas las pruebas estadísticas realizadas fueron pruebas de 2 colas con p < 0,05 consideradas estadísticamente significativas.

Presentado en la 31.ª Conferencia Científica Anual de Cirugía Plástica de la Universidad de Tokio, enero de 2020, Tokio, Japón.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Células endoteliales de los vasos sanguíneos

Verde de indocianina

Linfangiografía por fluoroscopia de infrarrojo cercano

Célula endotelial linfática

corazón linfático

Ultrasonografía de ultra alta frecuencia

Troncos linfáticos longitudinales laterales

Troncos linfáticos longitudinales paraabdominales

Troncos linfáticos longitudinales paraepigástricos

Troncos linfáticos subvertebrales longitudinales

Vasos linfáticos intraóseos vertebrales transversos

Venas intraóseas vertebrales transversales

Vena cava posterior

Venosa lateral

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Este trabajo fue financiado por las subvenciones KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (Números de subvenciones: 21K09764 y 18H04061). Nos gustaría agradecer sinceramente a la Sra. Kiku Shinano por el apoyo administrativo general ofrecido y al Dr. Jackson Chipaila, al Prof. Taizo Shiraishi, al Dr. Takahara Iino y a la Sra. Miyuki Namikata por ayudar con los experimentos.

Este trabajo fue financiado por las subvenciones KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (Números de concesión: 21K09764 y 18H04061).

Departamento de Cirugía Plástica y Reconstructiva, Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Prefectura de Mie, 514-8507, Japón

Chihena H. Banda, Makoto Shiraishi, Kohei Mitsui, Yoshimoto Okada, Kanako Danno, Ryohei Ishiura, Kaho Maemura y Mitsunaga Narushima

Facultad de Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad de Tsukuba, 1-1-1 Tennodai, Tsukuba, Prefectura de Ibaraki, 305-8571, Japón

Chikafumi Chiba

Departamento de Inmunoterapia Personalizada contra el Cáncer, Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Prefectura de Mie, 514-8507, Japón

Akira Mizoguchi

Departamento de Patología y Biología de Matriz, Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Prefectura de Mie, 514-8507, Japón

Kyoko Imanaka-Yoshida y Kazuaki Maruyama

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CHB, MS, MN, CC y Ko.M. diseñó el estudio. CHB, MS, MN, YO, KD, RI, Kah.M. y CC realizó la adquisición de datos. CHB, MS, MN, Ka.M y CC participaron en el análisis e interpretación de los datos. CHB redactó el manuscrito y MS, RI, MN, YO, KD, Ko.M., Ka.M., KIY, AM, CC revisaron el manuscrito. Todos los autores enumerados aprobaron la versión final del manuscrito y aceptaron ser personalmente responsables del contenido de este estudio.

Correspondencia a Mitsunaga Narushima.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Banda, CH, Shiraishi, M., Mitsui, K. et al. Análisis estructural y funcional del sistema linfático del tritón. Informe científico 13, 6902 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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Recibido: 19 diciembre 2022

Aceptado: 25 de abril de 2023

Publicado: 27 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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