Titanio

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 470 (2023) Citar este artículo

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El desarrollo de nuevos biomateriales con excelentes propiedades mecánicas y alta biocompatibilidad ha sido un desafío importante en las últimas décadas. Los metales nanocristalinos han brindado nuevas oportunidades en la producción de biomateriales de alta resistencia, pero es necesario mejorar la biocompatibilidad de estos nanometales. En este estudio, presentamos nanocompuestos de proteínas y metales como biomateriales de alta resistencia con una biocompatibilidad superior. Pequeñas proporciones de albúmina de suero bovino (2 y 5 vol.), una proteína abundante en el cuerpo de los mamíferos, se añaden al titanio y se sintetizan dos nanocompuestos mediante un proceso de deformación plástica severa de torsión a alta presión. Estos nuevos biomateriales muestran no solo una alta dureza similar al titanio puro nanocristalino, sino que también muestran una mejor biocompatibilidad (incluida la actividad metabólica celular, los parámetros del ciclo celular y el perfil de fragmentación del ADN) en comparación con el nanotitanio. Estos resultados abren una vía para diseñar nuevos compuestos biocompatibles empleando compuestos del cuerpo humano.

Los biomateriales están recibiendo una atención considerable para diferentes aplicaciones en los últimos años. El desarrollo de biomateriales metálicos para implantes es un tema particularmente crítico tanto desde el punto de vista técnico como de investigación debido al contacto directo de los implantes con los tejidos, huesos y fluidos del cuerpo humano bajo carga. El cuerpo humano es un entorno muy corrosivo y complejo que da lugar a la aparición de diferentes tipos de corrosión cuando se implanta un material artificial de carga en el cuerpo humano1,2,3. El líquido corporal contiene diversos compuestos orgánicos y una notable variedad de proteínas. Hay cerca de 105 proteínas diferentes disponibles en el cuerpo humano, cada una con una función específica. Entre estas proteínas, se informó que la albúmina es la proteína más abundante en el plasma y el líquido sinovial4 y, por lo tanto, está presente en cualquier tejido humano donde se pueda implantar un material artificial.

Una de las etapas iniciales que influye significativamente en la biocompatibilidad es la adsorción instantánea de proteínas de fluidos biológicos en superficies de biomateriales1,2. Además, la adsorción de proteínas se considera la primera y más crucial etapa que permite la adhesión de las células en la superficie del biomaterial y, por lo tanto, durante esta etapa tienen lugar fenómenos clínicos relevantes, como la osteointegración de los implantes ortopédicos1,2,3,4. La albúmina se identificó como el aglutinante de metales más fuerte entre las proteínas de la sangre humana, por lo que la adsorción de la albúmina en las superficies de los implantes juega un papel clave en la determinación de las funcionalidades de la superficie, como la biocompatibilidad, la corrosión y la tribología5. Las proteínas crean una capa gruesa en la superficie del material y las células detectan superficies extrañas a través de esta capa y comienzan a responder. Algunos informes sobre implantes revelaron claramente la presencia de capas que contenían proteínas en la superficie1,6, lo que indica la importancia de la interacción de las proteínas con las aleaciones biomédicas a nivel celular.

El titanio y sus aleaciones se han utilizado ampliamente como biomateriales potenciales en muchos implantes diferentes debido a su bajo módulo elástico, alta resistencia a la fatiga, excelente resistencia a la corrosión, mejor biocompatibilidad en comparación con otros biomateriales como aceros inoxidables y aleaciones de Co-Cr7,8 y baja densidad de 4,5 g/cm3, que es aproximadamente la mitad de los aceros inoxidables y las aleaciones de Co-Cr9. Sin embargo, el principal inconveniente del titanio y sus aleaciones es su menor resistencia y dureza en comparación con los aceros inoxidables y las aleaciones de Co-Cr7,8,9. Estudios recientes demostraron que la nanoestructuración del titanio es una solución eficaz para mejorar su resistencia y dureza sin deteriorar su biocompatibilidad10,11.

El uso exitoso de los implantes de titanio depende no solo de las propiedades mecánicas, como el módulo de elasticidad y la dureza, sino también de la osteointegración en la interfaz hueso-implante12. Sin embargo, debido a la falta de bioactividad de los materiales a base de Ti, no pueden unirse al hueso directamente y promover la formación de hueso nuevo en su superficie en las primeras etapas de la implantación13,14. Para mejorar la osteointegración de los materiales a base de Ti, se han empleado dos métodos principales basados ​​en modificaciones de la superficie: (1) el control de la topografía de la superficie con cambios físicos y/o químicos15,16; (2) la inmovilización de moléculas bioactivas en la superficie del implante17,18. El segundo enfoque, en el que se utilizan recubrimientos ricos en proteínas como colágeno19 y albúmina de suero bovino (BSA)5,20,21,22, puede mejorar la biocompatibilidad de las aleaciones basadas en Ti.

Varios estudios20,21,22,23,24 demostraron los efectos beneficiosos sobre la biocompatibilidad cuando las aleaciones a base de Ti se recubren con proteínas o se exponen a soluciones con altas concentraciones de BSA diluidas con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En Refs.20,21,22, se demostró que el recubrimiento con BSA inhibe el desprendimiento de hidrógeno y las reacciones de disolución anódica, aumenta la resistencia de las películas protectoras y mejora la adhesión celular al titanio puro y aleaciones a base de Ti como Ti-6Al -4V, Ti-6Al-7Nb y Ti-6Al-4V-1Zr (en % en peso). En una dirección similar, también se demostró que BSA mejora la estabilidad de la película pasiva de la aleación en concentraciones más altas en la aleación Ti-6Al-4V23. En el caso de la aleación Ti-3Cu (en % en peso) expuesta a una solución que contenía proteínas BSA24, la resistencia a la corrosión mejoró y la capacidad antibacteriana se redujo cuando aumentó el contenido de BSA en la solución. Sin embargo, pocos estudios25,26 revelaron que la adsorción de especies de proteínas como BSA en la superficie de aleaciones basadas en Ti puede mejorar la liberación de iones y dificultar la adhesión de las células.

A pesar de la importancia del recubrimiento de proteínas para mejorar la biocompatibilidad de los implantes, estos recubrimientos ricos en proteínas tienen una unión débil con el sustrato metálico. Debido a una unión tan débil, la delaminación puede ocurrir con el tiempo, lo que lleva al fracaso de esta técnica de recubrimiento para la implantación a largo plazo27,28. La inclusión permanente de una segunda fase, como las proteínas, en el material metálico puede ser una solución potencial para evitar el problema de la delaminación de los implantes recubiertos de proteínas, pero no ha habido intentos de producir tales compuestos de metal y proteína.

En este estudio, para producir biomateriales con alta resistencia y buena biocompatibilidad para la implantación a largo plazo, las partículas de proteína se insertan directamente como segunda fase en titanio nanoestructurado puro. Los nanocompuestos a granel se producen mediante un método de deformación plástica severa de torsión a alta presión (HPT). Los materiales muestran una alta dureza y una mejor biocompatibilidad que el titanio puro y no sufren problemas de delaminación, que es un problema general del recubrimiento con proteínas. Esta primera introducción de biomateriales compuestos de metal y proteína abre un nuevo camino para una amplia gama de aplicaciones biomédicas.

Para preparar los biomateriales se utilizó polvo de titanio con un nivel de pureza del 99,9 % y tamaños de partículas inferiores a 45 μm y polvos de BSA. BSA se adquirió de Amresco (Solon, OH, EE. UU.) con una pureza del 98 % y se usó sin ninguna purificación adicional. El polvo de titanio se mezcló mecánicamente con partículas de BSA en proporciones de 0, 2 y 5% en volumen. Las mezclas de polvo resultantes, como se muestra en la Fig. 1a-c, se consolidaron previamente bajo una presión aplicada de 300 MPa en forma de disco con un diámetro de 10 mm y un espesor de ~ 1 mm utilizando una prensa hidráulica manual. Luego se aplicó el método HPT a los discos compactados para preparar los nanocompuestos a granel con un buen nivel de mezcla. El método HPT es una técnica de deformación plástica severa en la que una muestra en forma de disco se comprime entre dos yunques a alta presión y se induce una tensión de corte al girar uno de los yunques con respecto al otro, como se muestra en la Fig. 1d 29. El proceso HPT se realizó a 2 GPa a temperatura ambiente durante 5 vueltas con una velocidad de rotación de 1 vuelta por minuto. El método HPT fue seleccionado para la síntesis de compuestos por tres razones principales. (1) Este método ha sido bien establecido como un proceso capaz de producir materiales nanoestructurados con una alta densidad de defectos de red30,31,32,33,34. (2) El método se puede utilizar para producir materiales compuestos a granel a partir de mezclas de polvo a temperatura ambiente33,34. (3) Los materiales basados ​​en Ti nanoestructurados procesados ​​por HPT pueden mostrar tanto una buena biocompatibilidad como una alta resistencia32,33,34,35.

( a, b ) imágenes SEM en modo BSE y ( c ) mapeos elementales EDS correspondientes de Ti + 5% en volumen BSA antes del procesamiento HPT. (d) Esquema del método HPT y sus yunques29. ( d, f, g ) Imágenes SEM a diferentes aumentos en modo BSE para Ti + 5 vol% de compuesto BSA después de 5 vueltas de HPT por debajo de 2 GPa.

Después del procesamiento HPT, las muestras se pulieron hasta obtener una superficie similar a un espejo para las investigaciones microestructurales, mecánicas y de biocompatibilidad. Los resultados de las propiedades mecánicas y la biocompatibilidad de las muestras procesadas con HPT se compararon con un titanio puro a granel de grano grueso de referencia (99,9 %) con un tamaño de grano medio de 200 μm que se recoció a 1073 K durante 1 h.

Se utilizó la técnica de microscopía electrónica de barrido (SEM) para investigar las características de la microestructura a nivel micrométrico. Las imágenes SEM se tomaron usando las señales de electrones secundarios y retrodispersados ​​(SE y BSE) bajo un voltaje de aceleración de 15 kV con un microscopio JEOL JSM-7900F o 25 kV con un microscopio FEG Philips XL-30 equipado con un Bruker Nano X-Flash Detector de espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDS) 6|60. Las imágenes SEM se tomaron a 4 mm del centro de los discos procesados ​​con HPT.

La microscopía electrónica de transmisión y transmisión de barrido (TEM y STEM) se realizó con un voltaje de aceleración de 200 kV utilizando un microscopio con corrección de aberraciones (JEOL JEM-ARM200F). Para TEM y STEM, se cortaron discos de 3 mm de diámetro a una distancia de 2 a 5 mm del centro del disco procesado con HPT usando una máquina de descarga eléctrica. Los discos de 3 mm fueron primero pulidos a un espesor de 100 µm con papeles abrasivos y luego a un espesor más pequeño para la transparencia de electrones por un pulidor electroquímico convencional de doble chorro usando una solución de 5% HClO4, 25% C3H3(CH2)2CH2OH y 70 % CH3OH, bajo un voltaje de 12 V a una temperatura de 263 K. El examen microestructural por TEM y STEM se realizó mediante imágenes de campo claro y oscuro (BF y DF), imágenes de campo oscuro anular de ángulo alto (HAADF), difracción de electrones de área seleccionada (SAED) y mapeos EDS.

Para el análisis de la estructura cristalina, las muestras se examinaron mediante el método de difracción de rayos X (XRD) utilizando un difractómetro X'Pert Panalytical equipado con un monocromador de grafito que opera a 45 kV y 40 mA con radiación Cu Kα (longitud de onda de λ = 0,15406 nm).

Para el análisis de propiedades mecánicas, se midió la microdureza Vickers utilizando una carga de 500 gf y un tiempo de permanencia de 15 s en la superficie superior de las muestras en cuatro direcciones radiales diferentes desde el centro hasta los bordes de los discos procesados ​​con HPT.

La biocompatibilidad se evaluó mediante dos pruebas principales: (1) ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio modificado (MTT); (2) análisis del ciclo celular y perfil de fragmentación del ADN por citometría de flujo. En la secuencia, se presentan los detalles de las pruebas de biocompatibilidad.

Las líneas celulares de preosteoblastos de ratón (MC3T3-E1) se mantuvieron en medio esencial mínimo alfa (α-MEM) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml (Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA, EE. UU.) en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2 a 310 K. Las células MC3T3-E1 fueron proporcionadas por el Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (USP), São Paulo , Brasil.

Las células MC3T3-E1 con una confluencia del 80% se tripsinizaron y luego se inactivaron con α-MEM y se contaron en un contador automático Countess II (Thermo Fisher Scientific Inc., Walthan, MA, EE. UU.). Los discos procesados ​​con HPT se colocaron en placas de 24 pocillos (1 disco por pocillo). Los discos se esterilizaron exponiéndolos durante la noche a luz ultravioleta en un gabinete de bioseguridad y se sembraron 60 µL de suspensión celular (1 × 105 células) en la superficie de los discos. La placa se incubó en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2 a 310 K por un período de 2 h. Luego, se agregó 1 mL de α-MEM a cada pozo y la placa se incubó en una atmósfera húmeda que contenía 5% de CO2 a 310 K.

El ensayo MTT se utiliza para medir la actividad metabólica celular como indicador de la viabilidad, proliferación y citotoxicidad celular. El ensayo MTT se basa en la reducción de una sal amarilla de tetrazolio, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) a cristales de formazán púrpura por células metabólicamente activas. Después de 48 h de cultivo en placas, se aspiraron los medios de cultivo y se añadió MTT (0,5 mg/mL en PBS) a las células y luego se incubaron durante 3 h en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2 a 310 K. Se descargó el medio de crecimiento y se Se agregaron 250 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo para disolver el MTT. La absorbancia de luz se determinó a 570 nm utilizando un lector de placas multipocillo espectrofotométrico de barrido (F5 Microplate Reader, Molecular Probes).

Para los ensayos de citometría de flujo, los discos procesados ​​con HPT se colocaron en una placa de 24 pocillos (1 disco por pocillo), se esterilizaron con luz ultravioleta durante 12 h y se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato. En cada disco se sembraron alrededor de 1,8 × 105 células. Después de 48 h de cultivo en placas, las células se recogieron y se lavaron con PBS. Se usó etanol frío (70 %) para fijar las células durante 30 min y 50 μg/ml de yoduro de propidio (PI) diluido en PBS que contenía 1 mg/ml de RNasa para teñir durante 30 min. Las células se mantuvieron a temperatura ambiente en la oscuridad. Los porcentajes de células en diferentes fases del ciclo se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo basado en núcleos teñidos con PI utilizando el software Accuri™ C6 (BD Biosciences).

Las Figuras 1a–c muestran imágenes SEM que incluyen el mapeo elemental EDS de elementos seleccionados del disco compacto antes del procesamiento HPT para compuestos que contienen 5% en volumen de BSA. En este caso, la superficie de esta muestra no recibió ningún procedimiento de pulido. Como puede verse por el contraste de composición en las imágenes de BSE (Fig. 1a,b), existe una mezcla razonable entre las partículas de titanio y BSA a nivel micrométrico. Las partículas grises se refieren al titanio con dimensiones que oscilan entre 10 y 45 μm, mientras que las partículas negras se refieren a la proteína BSA. BSA es un polímero lineal que contiene átomos de C, H, O, N y S4. El mapeo elemental que se muestra en la Fig. 1c confirma que las partículas negras corresponden a la proteína BSA que contiene átomos de carbono que están rodeados por una matriz de titanio.

Las Figuras 1e-g muestran imágenes de BSE para el compuesto que contiene 5% en volumen de BSA después del procesamiento HPT. Como indica el contraste de composición y el análisis EDS, las regiones negras están relacionadas con la proteína BSA. Estas imágenes muestran que después de la severa deformación plástica llevada a cabo por el procesamiento HPT, la proteína BSA se mezcla con partículas de titanio formando capas de proteína bien definidas que se distribuyen por toda la muestra, mientras que la fase de titanio mantiene su red tridimensional. La capacidad de HPT para formar una estructura en capas de titanio y BSA es consecuencia del efecto de la tensión de cizallamiento en la evolución microestructural balística del titanio y BSA, mientras que la alta presión hidrostática facilita la codeformación de dos componentes con diferentes estructuras y propiedades. Esta capacidad del método HPT ya se empleó para producir varios compuestos basados ​​en Ti, como compuestos de metal-metal36, compuestos de metal-cerámica37 y compuestos de metal-carbono38. Aquí, debe tenerse en cuenta que las microestructuras que se muestran en la Fig. 1e-g también se observaron cuando el compuesto Ti-BSA fue examinado por SEM desde la vista de la sección transversal, una característica que generalmente se observa en los metales procesados ​​con HPT30.

Los exámenes de la microestructura con mayor aumento utilizando STEM-HAADF y EDS, como se muestra en la Fig. 2a,b, confirman que el titanio y el BSA tienen una buena unión a escala nanométrica. Aunque se necesitan futuros cálculos teóricos para aclarar la naturaleza de esta unión, sus características deberían ser similares a las observadas para la absorción de proteínas en implantes de titanio en el cuerpo humano. El enlace entre el titanio y la proteína generalmente sigue dos pasos: (1) enlace de hidrógeno y (2) transferencia de protones39. Algunos estudios sugirieron que dicha unión se ve reforzada por la interacción del grupo OH con el titanio40,41, mientras que las simulaciones de dinámica molecular informaron la importancia de las interacciones electrostáticas de los grupos amida y carboxilo en la unión42,43.

Análisis STEM y TEM para Ti + 5 vol % BSA composite después de 5 vueltas de HPT por debajo de 2 GPa. ( a ) imagen HAADF y ( b ) y mapeo EDS correspondiente con Ti; ( c, f ) imágenes TEM-BF; ( d, g ) patrones SAED correspondientes a ( c, f ); y (c) imagen TEM-DF.

Se empleó el análisis TEM para explorar más características de la microestructura del material compuesto a nivel submicrométrico y nanométrico. La Figura 2 muestra imágenes TEM representativas para el compuesto con 5% en volumen de BSA después del procesamiento HPT. Las imágenes BF y DF (Fig. 2c, e) muestran la presencia de varios granos ultrafinos de titanio con tamaños nanométricos o submicrométricos con un tamaño de grano promedio de 90 nm. El patrón SAED (Fig. 2d) tomado de la región que se muestra en la Fig. 2c muestra anillos bien definidos, lo que sugiere la presencia de granos ultrafinos con orientaciones aleatorias en la región seleccionada. Los anillos aparentes en la Fig. 2d pertenecen al titanio con estructura hexagonal compacta (HCP). Una imagen BF (Fig. 2f) junto con el patrón SAED respectivo (Fig. 2g), tomado de una región del compuesto que contiene la proteína BSA, muestra la naturaleza amorfa de BSA que está bien caracterizada por el patrón de anillo de halo que se muestra en la Patrón SAED.

La Figura 3 muestra los patrones XRD para titanio puro y para las muestras que contienen 2 y 5 % en volumen de BSA después del procesamiento con HPT. Como bien se puede notar, los patrones XRD de todas las muestras muestran la presencia de una sola fase que se refiere a la estructura hexagonal de titanio (P63/mmc) en buena concordancia con el análisis TEM. No aparecen nuevas fases en los patrones XRD después del procesamiento HPT. La única diferencia entre los patrones de XRD está relacionada con la disminución de las intensidades de los picos de XRD con el aumento de la proporción de BSA.

Patrones XRD para titanio puro y para los composites que contienen 2 y 5 vol% de BSA después de 5 vueltas de HPT por debajo de 2 GPa.

Para tener una idea de las propiedades mecánicas de las muestras después de la adición de proteína BSA por procesamiento HPT, se comparó la microdureza Vickers obtenida a 4 mm del centro de los discos, donde la tensión de corte es máxima. La Figura 4 muestra los valores promedio de microdureza para las muestras después del procesamiento HPT. Los valores obtenidos para la microdureza son bastante similares entre las tres muestras procesadas con HPT, lo que demuestra que las pequeñas adiciones de BSA de hasta el 5% en volumen no influyen negativamente en la dureza. Los valores medidos están en el rango de 344 a 353 HV, lo que concuerda bien con los valores encontrados en la literatura para aleaciones a base de Ti procesadas por HPT34,44. La Figura 4 muestra que la dureza de los compuestos Ti-BSA es dos veces mayor que la dureza del titanio recocido de grano grueso de referencia.

Microdureza Vickers para titanio puro y para nanocompuestos que contienen 2 y 5 vol% de BSA producidos por 5 vueltas de HPT por debajo de 2 GPa en comparación con la dureza del titanio recocido de grano grueso.

Aquí, se deben mencionar dos puntos con respecto a las propiedades mecánicas. Primero, la dureza fue la más baja en el centro de los discos, pero aumentó al aumentar la distancia desde el centro del disco, como se muestra en la Fig. S1 de Información de apoyo. Estas heterogeneidades, que se deben a un aumento de la tensión de corte al aumentar la distancia desde el centro del disco, se pueden evitar aumentando el número de vueltas para que los valores de dureza desde el centro del disco hasta el borde se saturen hasta los estados estacionarios29,30. En segundo lugar, mientras que la consolidación de polvos de titanio puro por HPT dio como resultado un límite elástico a la tracción de 1 GPa y una ductilidad del 12 %45, la presencia de la fase proteica no dio como resultado ductilidad bajo tensión, un hecho que generalmente se observa en los compuestos de metal y cerámica. A pesar del buen rendimiento mecánico de los compuestos bajo cargas de compresión, su ductilidad limitada bajo tensión siempre debe tenerse en cuenta cuando se utilizan para cualquier aplicación, incluidas las aplicaciones biomédicas46.

La viabilidad celular de los nanocompuestos después del procesamiento HPT se evaluó mediante experimentos de cultivo celular in vitro empleando las células MC3T3-E1. Los resultados de la evaluación de biocompatibilidad a través del ensayo MTT se muestran en la Fig. 5. Cabe señalar que una mayor absorbancia de luz en la Fig. 5 indica una mayor actividad metabólica celular. En primer lugar, como puede verse claramente en la Fig. 5, todas las muestras procesadas por HPT presentan una biocompatibilidad superior en comparación con la referencia de titanio de grano grueso. En una dirección similar, Refs32,34,35 también mostró la mejora de la biocompatibilidad en aleaciones basadas en Ti después del procesamiento HPT. Además, entre las muestras procesadas por HPT en la Fig. 5, las muestras que contenían BSA mostraron una biocompatibilidad superior en comparación con aquellas muestras sin BSA. La mejora en la biocompatibilidad en las muestras procesadas con HPT parece ser proporcional al contenido de BSA y la muestra con 5% en volumen de BSA muestra el mejor comportamiento de biocompatibilidad. Dado que las proteínas adsorbidas en la superficie del implante median las interacciones célula-superficie, incluidas su diferenciación y proliferación, normalmente se espera que se logre un mejor proceso de osteointegración y, en consecuencia, una excelente integración tisular en los nanocompuestos de Ti-BSA, especialmente en las primeras etapas. de implantación.

Ensayo de viabilidad de células MTT examinado por absorbancia de luz a 570 nm para titanio puro y para nanocompuestos que contienen 2 y 5 % en volumen de BSA producidos por 5 vueltas de HPT a menos de 2 GPa en comparación con la dureza del titanio recocido de grano grueso. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de los experimentos realizados por cuadruplicado y comparados mediante ANOVA de Kruskal-Wallis y comparaciones por pares mediante la prueba de Mann-Whitney.

La Figura 6 muestra el perfil del ciclo celular de las células MC3T3-E1 para las muestras procesadas por HPT, incluida una muestra de referencia de titanio. Las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI), la fluorescencia emitida sirvió como señal de pulso y se determinó el área de la señal (FL2-A). Para el análisis del ciclo celular, se recolectaron 10.000 eventos en el histograma de FL2-A. En la Fig. 6a, los datos de PI están en un histograma con el recuento de células en el eje y y la intensidad de fluorescencia de PI en el eje x. El histograma muestra el número de celdas en tres fases diferentes: G0/G1; S y G2/M durante 48 h. Como se puede observar en la Fig. 6b, el número de células presentadas en las fases G0/G1, S y G2/M es bastante similar entre todas las muestras, lo que indica que la adición de BSA no promovió ninguna distorsión o anomalía, como aumento o disminución. el número de células en diferentes fases del perfil del ciclo. En otras palabras, el número de células en cada fase se mantiene inalterado durante el perfil del ciclo independientemente de la composición o ruta de procesamiento.

Perfil del ciclo celular de las células MC3T3-E1. (a) Histograma representativo de las muestras que muestra la distribución de las células en las fases individuales del ciclo celular en las fases G0/G1 (azul), S (roja) y G2/M (verde). (b) Análisis cuantitativo de distribución o proporción del número de células en cada fase, realizado a partir de al menos 10.000 eventos por muestra. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de los experimentos realizados por cuadruplicado y comparados mediante ANOVA de Kruskal-Wallis y comparaciones por pares mediante la prueba de Mann-Whitney.

La Figura 7 muestra la fragmentación del ADN de las células MC3T3-E1 para las muestras procesadas por HPT, incluida una referencia de titanio. En la Fig. 7a, el histograma de fragmentación del ADN celular revela que las muestras presentan valores en el rango de 1,5 a 2,0% para la fragmentación del ADN. Esto indica que la adición de BSA o incluso el procesamiento de HPT no induce un comportamiento inesperado en las muestras, especialmente porque los valores que se muestran en la Fig. 7b están dentro de un rango muy estrecho para soportar cualquier cambio significativo. Por lo tanto, de forma similar a la conclusión extraída del análisis del ciclo celular, la adición de BSA al titanio no induce la apoptosis en las células MC3T3-E1 al aumentar la fragmentación del ADN después de ser procesada por HPT.

Fragmentación de ADN de células MC3T3-E1. ( a ) Histogramas representativos del porcentaje de fragmentación celular. (b) El número de células con ADN fragmentado se muestra como porcentaje. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de los experimentos realizados por cuadruplicado y comparados mediante ANOVA de Kruskal-Wallis y comparaciones por pares mediante la prueba de Mann-Whitney.

En la presente investigación, se introdujeron nanocompuestos de proteína de metal con alta resistencia y buena biocompatibilidad para la implantación a largo plazo. Los nanocompuestos son mezclas de un metal biocompatible como el titanio y pequeñas cantidades de una proteína endógena como 2 y 5 vol% de BSA. El método HPT fue seleccionado para sintetizar estos nuevos compuestos porque el método asegura un buen nivel de mezcla a nivel nanométrico entre las dos fases y logra la nanoestructura deseable con alta dureza para aplicaciones biomédicas.

La caracterización inicial de los nanocompuestos de metal y proteína realizada mediante análisis SEM, STEM, TEM y XRD reveló interesantes aspectos microestructurales de estos nuevos biomateriales. Los composites mostraron un buen nivel de mezcla entre el titanio y la proteína BSA junto con la presencia de una estructura nanocristalina que contenía granos ultrafinos de titanio con un tamaño de grano promedio de 90 nm. La producción de granos ultrafinos y materiales nanocristalinos que muestran una mayor dureza es uno de los aspectos más atractivos de HPT para aplicaciones de biomateriales29,30,31,32,33,34,35. No se identificaron nuevas fases en los nanocompuestos metal-proteína después del proceso HPT, lo que indica que la alta dureza se debe a la nanoestructuración y no a la formación de la fase ω-Ti45. Debido a estas características microestructurales, los nanocompuestos de metal y proteína mostraron niveles de dureza dos veces más altos que la dureza del titanio de grano grueso de referencia. Además, la adición de BSA (hasta un 5% en volumen de BSA) no influyó negativamente en la dureza, lo que confirma que la adición de proteínas en pequeñas cantidades es una solución práctica para desarrollar biomateriales de alta resistencia.

La biocompatibilidad de los nanocompuestos de metal y proteína después del procesamiento HPT se probó mediante experimentos de cultivo celular directo empleando las células MC3T3-E1. Los resultados mostraron que el nanocompuesto metal-proteína que contenía 2 y 5 vol% de BSA presentó una biocompatibilidad superior en comparación con las referencias de titanio puro nanocristalino y de grano grueso. Más allá de eso, el compuesto que contenía 5% en volumen de BSA mostró el mejor comportamiento de biocompatibilidad entre todas las muestras. Otros aspectos importantes relacionados con la interacción de las células con el nanocompuesto metal-proteína también se mostraron en el perfil del ciclo celular y los resultados de fragmentación del ADN. Esas pruebas indicaron pruebas claras de que la adición de BSA al titanio no indujo ninguna distorsión o anomalía, como aumentar o disminuir el número de células en diferentes fases del perfil del ciclo y tampoco indujo la apoptosis en las células MC3T3-E1 por aumentando la fragmentación del ADN después de ser procesado por HPT. La biocompatibilidad superior de los nanocompuestos de metal y proteína se puede atribuir a la presencia de proteínas BSA en todo el material, incluidas sus superficies, que interactúan con las células MC3T3-E1 y muestran una excelente proliferación y adhesión celular. Cabe señalar que, aunque el aumento de temperatura durante HPT es de menor importancia para provocar la desnaturalización térmica47,48, la desnaturalización en frío y el proceso de desdoblamiento de proteínas de BSA pueden ocurrir bajo una presión alta de 2 GPa, como se sugiere en publicaciones anteriores49,50. A pesar de estos posibles cambios estructurales tridimensionales bajo alta presión, la BSA sigue siendo eficaz para mejorar la biocompatibilidad en los compuestos actuales de Ti-BSA.

Este efecto de biocompatibilidad positivo debido a la presencia de BSA en aleaciones con base de Ti concuerda bien con el efecto informado del recubrimiento de proteína en los implantes20,21,22,23,24. Si bien los implantes recubiertos de proteínas sufren deslaminación durante mucho tiempo, en este estudio se introdujo la proteína BSA como una segunda fase en titanio mediante la consolidación en frío a través del proceso HPT. Por lo tanto, se espera que esta nueva familia de nanocompuestos de metal y proteína sea mucho menos propensa al problema de la delaminación, aunque se requieren pruebas a largo plazo para confirmar este problema. Debido a que la consolidación en frío por HPT es aplicable a casi todos los tipos de compuestos, este estudio abre un camino para el diseño y la síntesis de una amplia gama de biomateriales de nanocompuestos de proteínas y metales.

En este estudio, presentamos nanocompuestos de metal y proteína como nuevos biomateriales con alta dureza y excelente biocompatibilidad. Los nanocompuestos se sintetizaron mezclando titanio metálico puro con albúmina de suero bovino (BSA), una proteína endógena de mamíferos, mediante torsión a alta presión. De este estudio se extrajeron las siguientes conclusiones.

La microscopía electrónica mostró un buen nivel de mezcla entre el titanio y la proteína BSA, mientras que el tamaño de grano del titanio estaba bien a nivel nanométrico.

La microdureza de los nanocompuestos de proteína metálica fue similar a la del titanio puro nanocristalino y más de dos veces mayor que la del titanio puro de grano grueso.

La difracción de rayos X mostró que la adición de BSA y el procesamiento posterior no promovieron la formación de nuevas fases en el material.

La viabilidad celular de las muestras, evaluada mediante experimentos de cultivo celular in vitro con células MC3T3-E1, mostró que la adición de un 5% en volumen de BSA da como resultado la mejor biocompatibilidad debido a la proliferación celular mejorada promovida por la presencia de biomoléculas de BSA.

La adición de BSA no promovió ninguna alteración en el perfil celular y la fragmentación del ADN, lo que indica que el biomaterial aquí estudiado sería una excelente opción para ser utilizado como implante de alta dureza y alta biocompatibilidad.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Artículo CAS Google Académico

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Este trabajo cuenta con el apoyo parcial de Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas del MEXT, Japón (JP19H05176, JP21H00150 y JP22K18737) y de la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP), Brasil (2019/06951-3). Queremos agradecer a la Prof. Cecilia Helena de Azevedo Gouveia del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (USP) por proporcionar las células MC3T3-E1.

Facultad de Ciencias Aplicadas, Universidad de Campinas (FCA-UNICAMP), Pedro Zaccaria, Limeira, 130013484-350, Brasil

Ricardo Floriano, Karina Danielle Pereira y Augusto Ducati Luchessi

WPI, Instituto Internacional para la Investigación de Energía de Carbono Neutro (WPI-I2CNER), Universidad de Kyushu, Fukuoka, 819-0395, Japón

kaveh edalati

Instituto de Biociencias, Universidad del Estado de Sao Paulo (UNESP), Rio Claro, Sao Paulo, Brasil

Augusto Ducati Luchessi

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RF: Conceptualización, Metodología, Validación, Papel de Escritura; KE: Conceptualización, Metodología, Validación, Escritura de Papel; KDP: Metodología, Validación, Papel de escribir; AVD: Conceptualización, Metodología, Validación, Papel Escrito.

Correspondencia a Ricardo Floriano.

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Floriano, R., Edalati, K., Pereira, KD et al. Nanocompuestos de proteína de titanio como nuevos biomateriales producidos por torsión a alta presión. Informe científico 13, 470 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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Recibido: 20 julio 2022

Aceptado: 19 de diciembre de 2022

Publicado: 10 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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